徐瀟穎， 梁晶晶， 趙超群， 陳萬勤， 劉 柱

(浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052)

氟蟲腈(Fipronil)是法國羅納-普朗克公司開發(fā)生產(chǎn)的一種高活性的苯基咪唑類廣譜性殺蟲劑[1]，2017年8月初，荷蘭爆出的波及全球食品安全問題的“毒雞蛋”事件使它成了世人矚目的焦點。但早在1993年氟蟲腈作為農(nóng)藥就被引入中國市場，主要通過干擾氯離子的通路，破壞昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)殺滅鱗翅目和直翅目的害蟲，以及在土壤中的鞘翅目害蟲的幼蟲，同時對于環(huán)戊二烯類、菊酯類、氨基甲酸酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的害蟲也有極高的敏感性[2,3]?，F(xiàn)有動物實驗研究表明，短期攝取大量氟蟲腈會對神經(jīng)系統(tǒng)造成不良影響，長期攝取則會損傷肝臟、甲狀腺和腎臟。除此之外，施用氟蟲腈后，通過環(huán)境中的氧化還原及光解作用，會生成氟甲腈(MB46513)、氟蟲腈砜(MB46136)、氟蟲腈硫醚(MB45950)等代謝物[4]，研究已證實氟甲腈砜對淡水生物的毒性比氟蟲腈高6倍以上[5,6]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織農(nóng)藥殘留聯(lián)席會議(JMPR)建立的氟蟲腈成人攝入量(ADI)為每天不超過0.0002 mg/kg體重[7]。歐盟規(guī)定茶葉中氟蟲腈的最大殘留限量(MRL)為0.005 mg/kg，日本對該限定值的設定在0.002 mg/kg。我國國家標準(GB 2763-2016)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中也對氟蟲腈在24項植物源性食品中的殘留限量進行了規(guī)定，但對于茶葉中的殘留限量未作規(guī)定。

我國茶葉資源豐富，但來自各茶葉進口國的非關稅壁壘使中國茶葉出口遇到前所未有的壓力，其中最嚴重的問題之一就包括農(nóng)藥殘留超標[8]。目前已有關于茶葉中氟蟲腈及其代謝物的殘留分析方法，主要包括氣相色譜法(GC)[9,10]、GC-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)、液相色譜法(LC)[11,12]以及LC-MS/MS[13,14]。其中，沈偉健等[15]及陳沙等[16]采用GC-MS/MS法實現(xiàn)了水果及水產(chǎn)品等不同基質中氟蟲腈的分析測定；寧霄等[17]通過LC-MS/MS法對動物源性樣品中的氟蟲腈及其代謝物進行分析。高效液相色譜-線性離子阱串聯(lián)質譜法具有多反應監(jiān)測-信息關聯(lián)采集-增強子離子掃描(MRM-IDA-EPI)檢測模式，能夠對未知化合物進行雙重定性，可排除假陽性結果，提高定性分析的準確度；同時高選擇性和高靈敏度的掃描獲得化合物的峰面積信息，進而對化合物進行定量分析。傳統(tǒng)的固相微萃取、加速溶劑萃取和凝膠電泳等前處理方法操作步驟繁瑣，且耗費較大。近年來，在農(nóng)藥殘留檢測過程中QuEChERS方法作為前處理凈化手段廣泛被應用，該方法具有精準度高、操作簡單、成本低廉等優(yōu)勢。針對茶葉樣品基質復雜，為達到更好的凈化效果，降低在后期分析過程中的基質效應[18,19]，本文通過改進QuEChERS方法，并結合線性離子阱靈敏度高、定量定性準確性好的優(yōu)點，建立快速、簡便、凈化效果好的監(jiān)測方法，不僅能夠有效應對突發(fā)性、大批量茶葉樣品中氟蟲腈及其代謝物的檢測需求，且檢測過程綠色環(huán)保[20,21]。該方法較傳統(tǒng)方法簡化了前處理操作，提高了檢測效率，并且降低了檢出限。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AB Qtrap5500質譜儀(美國，AB Sciex公司)；XR 30AD液相色譜儀(日本，Shimadzu公司)；Milli-Q超純水器(美國，Millipore公司)；渦旋混合器(上海琪特公司)；Multi-Prep快速勻漿儀(美國，Pro Scientific公司)。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈亞砜和氟蟲腈砜標準品(純度≥98%,Dr.Ehrenstorfer)；甲醇(質譜純,德國Merck公司)；乙腈(質譜純,德國Merck公司)；NH4Ac(分析純,國藥試劑公司)；多壁碳納米管(MWCNTs)(純度>97%,直徑20～40 nm,長度>5 μm)深圳市納米港科技有限公司；石墨化炭黑(GCB)、乙二胺-N-丙基(PSA)、十八烷基硅烷(C18)均購自于天津Agela公司。

1.2 樣品前處理

將市場購買的茶葉樣品放入食品粉碎機中制成粉末，稱取5.00 g樣品于50 mL離心管，加入20 mL乙腈，10 000 r/min下均質1 min，超聲提取10 min后，于5 000 r/min離心5 min，轉移上清液后，重復提取1 次，合并兩次上清液后待凈化。精確移取上述提取液4 mL于10 mL離心管中，加入0.5 g GCB及0.1 g MWCNTs后，渦旋2 min后，5 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，作為待測定液。

1.3 色譜-質譜條件

Agilent Poroshell色譜柱(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)。流動相A：5 mmol/LNH4Ac；流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：0～3.0 min，65%～72%B；3.0～4.0 min，72%～98%B；4.0～5.0 min，98%B；5.0～7.0 min，98%～65%B；7.0～10.0 min，65%B。流速：0.35 mL。進樣量：1 μL。柱溫：35 ℃。

離子源為電噴霧電離(ESI)源；掃描方式：負離子掃描模式；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；電噴霧電壓(IS)：-4 500 V；離子源溫度(TEM)：500 ℃；霧化氣壓力(GS1)：50 psi；輔助氣電壓(GS2)：50 psi；氣簾氣壓力(CUR)：40 psi。定性離子對、定量離子對、碰撞能量(CE)及去簇電壓(DP)見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的質譜參數(shù)條件Table 1 ESI-MS/MS parameters for fipronil and its metabolites

IDA(信息關聯(lián)采集)條件：在上述質譜條件下增加IDA監(jiān)測模式，監(jiān)測響應值超過1 000的最強的一個離子，建立EPI掃描模式，掃描分子量200～500 Da的離子，掃描速率10 000 Da/s。EPI電壓參數(shù)：DP：-50 V；CE：-30 V；CES(Collision Energy Spared)：25 V。

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜條件的優(yōu)化

氟蟲腈及其代謝物結構相似且為弱極性，因此選擇C18色譜柱進行分離，通過比較Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)以及Zorbax Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)，發(fā)現(xiàn)4種化合物在上述三種不同規(guī)格色譜柱上峰形對稱、峰寬窄。由于本文在質譜分析時，需通過EPI模式獲得增強子離子流圖，而該模式下良好譜圖獲得需要不同的目標化合物在分析柱上相互分離。通過對不同梯度洗脫程序的比較，Agilent Poroshell 120 EC-C18柱可實現(xiàn)氟蟲腈及其代謝物的良好分離效果，因此選擇該色譜柱作為分析柱。

氟蟲腈及其代謝物在結構式上都有氨基，既可以通過得到一個質子形成[M+H]+，也可以失去一個質子形成[M-H]-，但是在負離子模式下干擾更小，基線響應更低，因此本文采用負離子模式。為在該掃描模式下獲得的目標物響應更高，分別對水-甲醇、水-乙腈、5 mmol/L NH4Ac溶液-甲醇以及0.1%甲酸水溶液-甲醇4種流動相體系進行考察。結果顯示，以5 mmol/L NH4Ac溶液-甲醇作為流動相時目標物的響應值最大，且穩(wěn)定性良好，所以，選擇其作為流動相條件。

2.2 MRM-IDA-EPI掃描模式的建立

圖1 氟蟲腈及其代謝物的MRM和EPI圖譜(200 ng/mL)Fig.1 MRM and EPI of fipronil and its metabolites(200 ng/mL) a.MRM chromatogram of Fipronil;b.MRM chromatogram of Fopronil-Desulfinyl;c.MRM chromatogram of Fopronil-Sulfone;d.MRM chromatogram of Fopronil-Sulfine;e.EPI spetrum of Fipronil;f.EPI spetrum of Fopronil-Desulfinyl;g.EPI spetrum of Fopronil-Sulfone;h.EPI spetrum of Fopronil-Sulfine.

分別取氟蟲腈及其代謝物混合工作溶液(濃度200 ng/mL)，通過對特征子離子的選擇、CE和DP的優(yōu)化最終得到MRM參數(shù)。然后利用MRM-IDA-EPI模式，按照常規(guī)定量方法設定目標物的MRM離子對，當MRM通道采集信號的強度超過預設值后，就會觸發(fā)EPI增強子離子掃描模式，進而得到相應化合物的增強二級離子全掃描質譜圖；同時建立標準物質EPI質譜庫輔助定性。而MRM采集的數(shù)據(jù)可同時作為定量分析的數(shù)據(jù)。相比于MRM模式，EPI譜圖由離子阱采集，增強了二級碎片子離子掃描，提高了靈敏度，且為全掃描質譜圖，確證信息更為豐富，可以有效輔助痕量水平或檢出限濃度樣品的定性確證，彌補了傳統(tǒng)四極桿MRM模式對低濃度樣品的定性難題。圖1中顯示了10 ng/mL相同濃度目標化合物在MRM-IDA-EPI模式與傳統(tǒng)MRM模式下得到的離子流圖，可以發(fā)現(xiàn)，氟蟲腈通過EPI模式掃描獲得的離子流圖響應值是其MRM離子流圖響應值的3倍，氟蟲腈砜EPI獲得的離子流圖的響應值是其MRM離子流圖響應值的2倍。將獲得子離子的全掃描譜圖，與對照品建立的的特征譜庫進行比對，完成進一步的確證。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇在植物源性食品的農(nóng)藥殘留分析中常用的提取溶劑有水、乙腈、丙酮、二氯甲烷等。采用純水提取時，茶葉中色素、糖、氨基酸、多酚類等大量水溶性雜質被提取出，基質干擾嚴重，導致目標物離子化效率低，方法定量限難以達到。所以本文采用有機溶劑進行直接提取，在不同的有機溶劑中，以乙腈的提取效果最好，提取出的雜質少，有利于后續(xù)的凈化。

2.3.2 QuEChERS方法的優(yōu)化在傳統(tǒng)的QuEChERS方法中，采用的凈化吸附劑是GCB、PSA以及C18吸附劑。其中GCB作為弱極性或非極性吸附劑，能夠有效去除色素和甾醇等疏水性化合物；PSA通過陰離子交換吸附蛋白質、糖類和極性較高的酸性物質；C18吸附脂肪和脂類等非極性干擾物。而MWCNTs可通過π-π共軛等相互作用力和較強的表面吸附作用去除基質，也具有凈化效果。本實驗分別考察上述凈化粉末，其中GCB、PSA、C18三種吸附劑添加量分別為50、100、500 mg，MWCNTs的添加量在10、20、100 mg，分別對4 mL樣品提取溶液進行凈化后，在200～700 nm范圍內進行紫外掃描。結果顯示，隨吸附劑添加量的增加，對紫外吸收在380～420 nm及640～680 nm的基質凈化效果顯著提高，其中640～680 nm處的吸光物質主要為葉綠素，380～420 nm處則為葉黃素，GCB和MWCNTs對色素的凈化效果較C18、PSA更好。在波長280 nm處出現(xiàn)的吸光峰主要是由于茶葉中的天然多酚類物質，當GCB的添加量達到500 mg時，天然多酚類物質類物質被明顯吸附。

對于不同凈化劑的凈化效果，通過三維熒光光譜圖進行輔助分析。茶葉基質中存在大量具有熒光特性的成分，此時采用三維掃描，可以得到在每個激發(fā)波長以及發(fā)射波長下的熒光值，通過特征峰的比較，考察凈化后樣品的三維熒光光譜圖(圖略)。激發(fā)波長大于等于發(fā)射波長部分為非熒光，結果顯示PSA和C18凈化后的提取液在三維熒光掃描下的譜圖與未凈化提取液的圖譜相似，發(fā)射波長在660～680 nm處有多個明顯峰，說明兩者對茶葉提取液中具有熒光特性的基質吸附效果不明顯。經(jīng)過GCB凈化后，發(fā)射波長在660～680 nm的峰強度及數(shù)量下降明顯，但激發(fā)波長260～280 nm，發(fā)射波長300～350 nm處仍存在明顯吸收峰。而經(jīng)MWCNTs吸附后，發(fā)射波長在660～680nm處的峰，相比于樣品溶液強度下降，激發(fā)波長260～280 nm，發(fā)射波長300～350 nm處的吸收峰強度較GCB凈化后的有所下降。因此GCB和MWCNTs同時使用可以達到較好的凈化效果。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限用基質溶液配制氟蟲腈及其代謝物1.0～20.0 μg/L系列標準溶液，繪制標準曲線，以目標物的峰面積Y為縱坐標，質量濃度X(μg/L)為橫坐標進行線性擬合，并以添加樣品色譜峰響應值為3倍噪音的濃度為方法檢出限(LOD)，以10倍噪音的濃度為方法定量限(LOQ)，結果見表2。氟蟲腈及其代謝物在1.0～20.0 μg/L濃度范圍內呈良好線性關系，相關系數(shù)均在0.999以上，檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg，可滿足歐盟及日本對茶葉中氟蟲腈殘留的限量要求。

表2 氟蟲腈及其代謝物的回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Ranges,regression equations,correlation coefficients(R2) and LODs and LOQs of fipronil and its metabolites

2.4.2 準確度與精密度考察在陰性紅茶樣本中加入混合標準溶液，使加標水平為1、3和10倍信定量限，每個水平平行測定6次，采用基質標準曲線進行定量分析，計算回收率及相對標準偏差(RSD)對方法的準確性和可靠性進行驗證，結果列于表3。結果顯示，氟蟲腈及其代謝物的平均加標回收率在82.7%～98.1%之間，相對標準偏差(RSD)在1.3%～4.6%之間，證明本方法的準確度和精密度良好，滿足茶葉中氟蟲腈及其代謝物的測定要求。

表3 氟蟲腈及其代謝物在紅茶中的加標回收率及精密度(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of fipronil and its metabolites in spiked black tea samples(n=6)

2.5 實際樣品的測定

利用本實驗建立的線性離子阱串聯(lián)質譜法隨機對市售的本省生產(chǎn)的20批茶葉(紅茶、綠茶、烏龍茶和茉莉花茶各5批)進行了檢測。檢測結果顯示，綠茶、烏龍茶和茉莉花茶各有一批檢出，具體檢出情況見表4。在檢出氟蟲腈及其代謝物的三批茶葉中氟甲腈砜的檢出量都高于0.03 mg/kg，而目前的檢測標準(GB 23200.34-2016)中僅規(guī)定了氟蟲腈的定量限為0.002 mg/kg，且對茶葉中氟蟲腈及其代謝物的最大殘留量并未規(guī)定，而氟蟲腈代謝物的毒性遠高于氟蟲腈，因此從安全角度考慮，分析氟蟲腈及其代謝物殘留更有意義[5]。根據(jù)本文方法氟蟲腈及其代謝物的定量限1.0 μg/kg，綠茶樣品中除氟蟲腈亞砜外，其余化合物都有檢出，茉莉花茶樣品中只有氟蟲腈砜有檢出，烏龍茶中的氟蟲腈及其代謝物都有檢出，對有檢出的物質，將樣品采用MRM-IDA-EPI掃描模式獲得的EPI譜圖與采用標準物質建立的EPI譜庫進行比對后得到確證結果。采用國家標準方法(GB 23200.115-2018)《雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯(lián)用法》對陽性樣品進行確證，兩種方法得到的結果偏差在10%以內，說明本方法的結果具有可靠性。

表4 檢出氟蟲腈及其代謝物的茶葉樣品的檢測結果Table 4 Determination results for tea samples containing fipronil and its metabolites

3 結論

本研究采用QuEChERS方法，結合高效液相色譜-線性離子阱-串聯(lián)質譜法測定茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留量的檢測方法。本方法樣品前處理簡單快速、回收率高，精密度和準確度均能滿足痕量分析的要求，方法靈敏度優(yōu)于現(xiàn)行國家標準，且通過建立EPI譜庫可對疑似陽性樣品進行確證。為其在茶葉種植過程中的違規(guī)使用的監(jiān)管監(jiān)測提供理論依據(jù)和技術支撐。