范超中，莊滿意，溫 浩，李晨晨，普一涵，呂亞莉，李 靜

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

白藜蘆醇（Resveratrol，RES） 又名芪三酚，是一類主要存在于葡萄、虎杖、藜蘆和花生等植物中的含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮二苯乙烯多酚類化合物[1]，作為一種天然的食品活性成分，是一類具有極大價(jià)值及潛力的抗氧化類藥物[2]，被美國(guó)《抗衰老圣典》列為100 種最有效的抗衰老物質(zhì)之一，在食品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景。但其水溶性較低（僅2.68 mg/L）、穩(wěn)定性較差、遇熱見(jiàn)光易誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換、半衰期短（8～14 min）、代謝和排泄過(guò)于迅速[3-4]、生物利用度低等缺點(diǎn)嚴(yán)重影響了生理活性的發(fā)揮。因此，探究提高白藜蘆醇的水溶性，促進(jìn)其吸收并提高其生物利用度的方法，是目前食品營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難題。

作為一種被廣泛研究的遞藥載體，脂質(zhì)體具有無(wú)毒、兩親和生物可降解性等特征，可有效包裹維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、抗氧化劑等各類生物分子[5]。利用脂質(zhì)體對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行包裹構(gòu)建遞藥體系，可以有效地解決白藜蘆醇自身的穩(wěn)定性問(wèn)題，提高其在體內(nèi)傳遞有效成分的效率及吸收利用率[2，6]。然而，脂質(zhì)體成膜材料含有不飽和脂肪酸鏈的磷脂，容易導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，易于融合形成大顆粒，從而引起藥物滲漏，在某種程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG） 是迄今為止已知蛋白和細(xì)胞吸收水平最低的親水聚合物[7]，因其無(wú)毒性和良好的生物相容性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。目前，白藜蘆醇脂質(zhì)體在體外消化的研究并不多見(jiàn)，探究白藜蘆醇脂質(zhì)體在模擬胃腸道消化時(shí)的釋藥特征頗有必要。因此，采用低成本、操作簡(jiǎn)便的薄膜超聲法設(shè)計(jì)單因素優(yōu)化試驗(yàn)制備白藜蘆醇脂質(zhì)體，利用PEG-2000 對(duì)其修飾，采用紅外光譜分析脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)，建立胃腸道連續(xù)消化體系，開(kāi)展體外模擬消化研究。對(duì)提高白藜蘆醇生物利用度具有潛在的理論價(jià)值和應(yīng)用前景，也為拓展以脂質(zhì)體為載體所建立的遞藥體系在食品藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白藜蘆醇、大豆卵磷脂、膽固醇、胃蛋白酶、胰蛋白酶，均為生物純，索萊寶生物科技有限公司提供；PEG-2000（分析純），天津大茂化學(xué)試劑廠提供；三氯甲烷（分析純），天津市國(guó)藥集團(tuán)提供；聚乙烯醇（PVA），Mw13000-23000，87%～89%水解度，Sigma-Aldrich；氯化鈉（分析純），天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司提供；磷酸氫二鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、甲醇、無(wú)水乙醇、磷酸氫二鉀、鹽酸，均為分析純，天津市化學(xué)試劑一廠提供。

1.2 儀器與設(shè)備

WE-Z 型水浴恒溫振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品；DK-8D 型電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；TGL-16M 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；DHG 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品；Vector22 型傅立葉變換紅外光譜儀，德國(guó)布魯克光譜儀公司產(chǎn)品；TU-1810 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；FG2 型便攜式pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司產(chǎn)品；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；RS-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；ALPHA 1-2 型CHRIST 冷凍干燥機(jī)，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；HJ-6型磁力攪拌電熱套，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 白藜蘆醇脂質(zhì)體的制備

采用薄膜超聲法制備白藜蘆醇脂質(zhì)體。準(zhǔn)確稱取大豆卵磷脂、膽固醇和RES，加入30 mL 1∶1 混合的甲醇與三氯甲烷，溶解攪拌90 min 后，于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，形成均勻的暗黃色薄膜，加入20 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH 值7.4） 洗膜，攪拌40 min，于20～25 ℃下水浴超聲20 min，得到白藜蘆醇脂質(zhì)體（RES-L）；加入20 mL PEG-2000 的磷酸鹽緩沖溶液（pH 值7.4） 洗膜，按上述方法操作，得到修飾的白藜蘆醇脂質(zhì)體（PEG-RES-L）。

1.4 包封率的測(cè)定

（1） 配置空白溶媒。吸取體積分?jǐn)?shù)95%乙醇6 mL，加入磷酸鹽緩沖溶液（pH 值7.4） 定容至10 mL。

（2） 將制備好的RES-L 或PEG-RES-L 移入10 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心30 min，吸取200 μL 上清液后加入95%乙醇6 mL，再以磷酸鹽緩沖溶液（pH 值7.4） 定容至10 mL，于波長(zhǎng)306 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算游離的白藜蘆醇量（A1）。

（3） 取RES-L 或PEG-RES-L 原液200 μL 加入95%乙醇6 mL，再以磷酸鹽緩沖溶液（pH 值7.4）定容至10 mL，于波長(zhǎng)306 nm 處測(cè)定吸光度，可得包封與未包封的白藜蘆醇總量（A2）。

根據(jù)下列計(jì)算公式，得到樣品中白藜蘆醇的包封率[8]：

式中：EE——包封率，%；

A1——游離的白藜蘆醇量，mg；

A2——包封與未包封的白藜蘆醇總量，mg。

1.5 白藜蘆醇脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化

（1） 大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比。按照大豆卵磷脂∶膽固醇= 2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1測(cè)定脂質(zhì)體的包封率，確定大豆卵磷脂與膽固醇的最佳質(zhì)量比。

（2） 卵磷脂與白藜蘆醇的質(zhì)量比。按照大豆卵磷脂∶RES = 10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1測(cè)定包封率，確定卵磷脂和白藜蘆醇的最佳質(zhì)量比。

（3） PEG-2000 質(zhì)量濃度的影響。配制0.25，0.50，1.00，1.50 mg/mL PEG-2000 的磷酸鹽緩沖溶液，測(cè)定脂質(zhì)體的包封率，確定最佳的PEG-2000 質(zhì)量濃度。

包封率最高的PEG-RES-L 做凍干處理，備用。

1.6 紅外光譜（FTIR） 分析

分別取干燥的PEG-2000，RES，PEG-RES-L 凍干粉末1 mg 與溴化鉀150 mg，研磨混勻，70 MPa下壓透明薄片，測(cè)定400～4 000 cm-1的紅外光譜。

1.7 體外消化試驗(yàn)

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2010 版二部附錄所述的溶出度測(cè)定方法，對(duì)透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量為8 000～12 000） 沸水煮10 min，再用蒸餾水進(jìn)行清洗，再泡于蒸餾水中備用。配置體外消化試驗(yàn)所用到的模擬胃液（Simulated gastric fluid，SGF）及模擬小腸液（Simulated intestinal fluid，SIF），37℃下備用，模擬白藜蘆醇脂質(zhì)體在體內(nèi)胃腸道連續(xù)消化的情況。

SGF 配方：配置500 mL SGF 需加入1.0 g NaCl固體粉末1.6 g 胃蛋白酶（Pepsin），使用去離子水作為溶劑，用濃度為0.1 mol/L 的鹽酸溶液調(diào)pH 值至1.2±0.1。

SIF 配方：配置500 mL SIF 需加入3.4 g 磷酸氫二鉀和1.6 g 胰蛋白酶（Trypsin），使用去離子水作為溶劑，用濃度為0.2 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)pH 值至7.5±0.1。

以模擬胃液及模擬腸液為釋放介質(zhì)，分別精密稱取最佳包封率下0.2 g 制備好的PEG-RES-L 冷凍干燥粉末和148 mg RES 原料（RES 的量由制備好的PEG-RES-L 的最優(yōu)包封率換算得來(lái)），移入經(jīng)上述方法處理過(guò)的透析袋中，并向其中加入SGF 10 mL，置于含有50 mL SGF 的帶塞錐形瓶中，再放入WE-Z 型水浴恒溫振蕩器，于37 ℃條件下，以轉(zhuǎn)速100 r/min 實(shí)時(shí)取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)加等體積的新鮮釋放介質(zhì)，120 min 后向透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量為8 000～12 000） 中加入SIF 10 mL 繼續(xù)反應(yīng)，同時(shí)釋放液中補(bǔ)充50 mL SIF，取樣。于波長(zhǎng)306 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算消化率。采用相同的方法測(cè)定白藜蘆醇及未經(jīng)修飾的白藜蘆醇脂質(zhì)體的消化行為，比較RES，RES-L 和PEG-RES-L 在體外模擬胃腸道連續(xù)消化時(shí)的情況。

1.8 白藜蘆醇脂質(zhì)體的穩(wěn)定性試驗(yàn)

將等量RES-L 和PEG-RES-L 于4 ℃下避光保存，分別在第2，4，6 天進(jìn)行包封率測(cè)定，分析其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化

2.1.1 大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比

大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)白藜蘆醇脂質(zhì)體包封率的影響見(jiàn)表1。

表1 大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)白藜蘆醇脂質(zhì)體包封率的影響

由表1 可知，當(dāng)大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為2∶1 和6∶1 時(shí)，得到的包封率較高，分別為88.9%和89.6%。一般而言，膽固醇因其表面活性劑作用可以提高水油混合型乳液的穩(wěn)定性。因此，在構(gòu)建脂質(zhì)體載藥體系過(guò)程中其占比與制備后載藥脂質(zhì)體的包封率呈正相關(guān)；但是，當(dāng)膽固醇含量超過(guò)該比例范圍時(shí)，磷脂含量過(guò)低，易導(dǎo)致成膜困難，再加之人體所能消化的膽固醇量有限，無(wú)法利用和消化的膽固醇會(huì)在血液中積累。因此，考慮到脂質(zhì)體的穩(wěn)定性及膽固醇含量對(duì)人體的影響，選擇6∶1 作為大豆卵磷脂與膽固醇的最佳質(zhì)量比。

2.1.2 脂藥比的影響

固定大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為6∶1，改變大豆卵磷脂和白藜蘆醇質(zhì)量比。

脂藥比對(duì)白藜蘆醇脂質(zhì)體包封率的影響見(jiàn)表2。

表2 脂藥比對(duì)白藜蘆醇脂質(zhì)體包封率的影響

由表2 可知，隨著脂藥比的增大，RES-L 包封率先上升后下降，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)增加脂質(zhì)體量可以更有效地包裹藥物，但當(dāng)脂藥比超過(guò)20∶1 后，包封率下降，可能會(huì)造成脂質(zhì)體及藥物的雙重?fù)p失。因此，選擇大豆卵磷脂與白藜蘆醇的最佳質(zhì)量比為20∶1，白藜蘆醇脂質(zhì)體包封率可達(dá)86.10%。

2.1.3 PEG-2000 質(zhì)量濃度的影響

采用0.25，0.50，1.00，1.50 mg/mL 的PEG-2000磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行洗膜，測(cè)定PEG-RES-L 包封率。

PEG-2000 質(zhì)量濃度對(duì)PEG-RES-L 包封率的影響見(jiàn)表3。

表3 PEG-2000 質(zhì)量濃度對(duì)PEG-RES-L 包封率的影響

由表3 可知，當(dāng)PEG-2000 磷酸鹽緩沖溶液的質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)PEG-RES-L 具有最大的包封率。因此，選擇1mg/mL PEG-2000 磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行脂質(zhì)體制備。

2.2 白藜蘆醇脂質(zhì)體的分子結(jié)構(gòu)分析

RES，PEG-200 及PEG-RES-L 的紅外光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 RES，PEG-200 及PEG-RES-L 的紅外光譜圖

由圖1 可知，RES 在3 250 cm-1處有酚羥基吸收峰，在1 620，1 540，1 500 cm-1處有苯環(huán)吸收峰，在965 cm-1處有反式-C = C- 特征吸收，700 cm-1處為順式-C = C- 的特征吸收[9]。比較RES，PEG- 2000 與PEG-RES-L 的FTIR 圖譜發(fā)現(xiàn)，RES 的光譜特征消失。其原有的許多特征峰強(qiáng)度和峰型都發(fā)生了變化，強(qiáng)度大為減弱峰型也不再尖銳，甚至不再出現(xiàn)，這表明所形成的脂質(zhì)體已經(jīng)成功包埋了RES，使其分子振動(dòng)受到限制而不能顯示其原有的紅外特征。

同時(shí)，PEG-2000 的羥基吸收峰3 430 cm-1變寬，2 889 cm-1吸收峰向長(zhǎng)波數(shù)2 925 cm-1移動(dòng)，表明在脂質(zhì)體的形成過(guò)程中發(fā)生了藍(lán)移現(xiàn)象，1 467，1 345，1 280 cm-1的吸收峰也消失不見(jiàn)了，這些都表明在脂質(zhì)體形成過(guò)程中發(fā)生了一定程度的化學(xué)反應(yīng)，可能是由于RES 上的羥基結(jié)構(gòu)與PEG-2000長(zhǎng)鏈上的氧原子發(fā)生了氫鍵締合作用，將聚乙二醇成功修飾到白藜蘆醇脂質(zhì)體上。

2.3 體外模擬消化研究

脂質(zhì)體中藥物釋放機(jī)理復(fù)雜，藥物在脂質(zhì)體中包埋的位置、藥物本身的分子大小和性質(zhì)、脂質(zhì)體的粒徑大小和密度及釋放環(huán)境等對(duì)藥物從膠囊內(nèi)的釋放均有影響。將RES，RES-L 及PEG-RES-L 分別加入含有50 mL 的胃液中，于37 ℃下以轉(zhuǎn)速 100 r/min 反應(yīng)120 min 后向透析袋中加入等體積腸液，繼續(xù)反應(yīng)120 min，測(cè)定吸光度，計(jì)算RES，RES-L及PEG- RES-L 在4 h 內(nèi)體外模擬胃腸道連續(xù)消化的結(jié)果。

PEG-RES-L，RES-L 與RES 模擬胃腸道連續(xù)消化釋放圖見(jiàn)圖2。

圖2 PEG-RES-L，RES-L 與RES 模擬胃腸道連續(xù)消化釋放圖

由圖2 可知，RES 在4 h 內(nèi)的累計(jì)消化率最高，為45.88%；RES-L 次之，為35.82%；而PEG- RES-L的消化率最低，僅為26.44%，且具有更明顯的緩釋效果。從藥物釋放曲線可以看出PEG-RES- L，RES-L 在第0～30 min 內(nèi)消化較快，而在第30～120 min 內(nèi)消化平穩(wěn)，這是由于在制備過(guò)程中有部分未被包裹的RES 沉淀吸附在其表面，當(dāng)樣品進(jìn)入模擬胃液后，這部分RES 會(huì)首先擴(kuò)散溶解。此外，3 種樣品的消化率均在第120 min 時(shí)大量增加，體外消化體系中加入了模擬腸液，表明脂質(zhì)體在模擬腸液的消化中消化速率增大，PEG-RES-L 在體外模擬胃腸道的消化過(guò)程中累計(jì)釋放量更低，較未包裹的RES 及未經(jīng)修飾的RES-L 更能在復(fù)雜的人體環(huán)境內(nèi)維持穩(wěn)定，且具有一定的緩釋效果，這對(duì)于提高白藜蘆醇在人體內(nèi)的生物利用率有著積極意義。

經(jīng)PEG-2000 修飾的白藜蘆醇脂質(zhì)體的消化情況見(jiàn)圖3。

圖3 經(jīng)PEG-2000 修飾的白藜蘆醇脂質(zhì)體的消化情況

圖3 更為直觀地展示了PEG-RES-L 在體外模擬胃腸道消化的情況，在連續(xù)測(cè)定的4 h 內(nèi)，PEGRES-L 在胃液環(huán)境中釋放量占總釋放量的29.93%，而加入腸液后，胃腸液累計(jì)釋放量達(dá)70.06%。

2.4 穩(wěn)定性測(cè)試

包封率是脂質(zhì)體對(duì)于藥物的包封能力的直接體現(xiàn)，是否能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定地包裹藥物，降低藥物泄漏率是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)。表4 分別測(cè)定了RES-L 及PEG-RES-L 原液及離心后上清液在4 ℃避光保存時(shí)第2，4，6 天的吸光度值，并計(jì)算包封率。

白藜蘆醇脂質(zhì)體穩(wěn)定性分析見(jiàn)表4。

表4 白藜蘆醇脂質(zhì)體穩(wěn)定性分析

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RES-L 經(jīng)過(guò)6 d 的穩(wěn)定性測(cè)試，包封率下降幅度較大，從77.25%下降至25.08%；而PEG-RES-L 在6 d 里包封率下降了18.32%，由此可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)PEG-2000 修飾的白藜蘆醇脂質(zhì)體在包封性能上更加穩(wěn)定，更能抵抗長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)環(huán)境的溫度、pH 值、濕度等因素對(duì)于脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響。

3 結(jié)論

利用薄膜超聲法制備了PEG-2000 修飾的白藜蘆醇脂質(zhì)體。單因素試驗(yàn)最終確定大豆卵磷脂∶膽固醇（質(zhì)量比） = 6∶1，大豆卵磷脂：RES（質(zhì)量比） =20∶1，PEG-2000 磷酸鹽緩沖溶液質(zhì)量濃度為 1 mg/mL 時(shí)，PEG-RES-L 的包封率最好。紅外光譜圖證實(shí)了RES 被成功包裹進(jìn)脂質(zhì)體內(nèi)，PEG-2000 通過(guò)氫鍵作用修飾到了白藜蘆醇脂質(zhì)體上。體外消化研究結(jié)果表明，修飾的PEG-RES-L 在體外模擬胃腸道連續(xù)消化體系中消化率較低，為26.44%；而RES 及RES-L 的 消 化 率 分 別 為 45.88% 和 35.82% ；PEG-RES-L 在胃液中的累積釋放量?jī)H為總釋放量的29.93%，遠(yuǎn)低于在腸道的釋放量（70.06%）。PEG-RES-L 在體外模擬胃腸道的消化較RES 及未修飾的RES-L 更能在復(fù)雜的人體環(huán)境內(nèi)維持穩(wěn)定。穩(wěn)定性試驗(yàn)證明，經(jīng)過(guò)PEG-2000 修飾的白藜蘆醇脂質(zhì)體在包封性能上更加穩(wěn)定，更能抵抗長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)環(huán)境的溫度、pH 值、濕度等因素對(duì)于脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響。