李浩然 張樹(shù)偉 王金英 黃小雄 彭宏祥 徐炯志 潘介春 朱建華 譚春露 李平 丁峰

摘 ?要：以龍眼成熟葉片為材料，克隆龍眼MYB-related基因家族TRF2-like基因，命名為DlTRF2-like，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析。DlTRF2-like基因?qū)儆贛YB-related家族的TRF-like亞家族，ORF長(zhǎng)度是909 bp，編碼含有302個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測(cè)該基因定位于細(xì)胞核，同源基因進(jìn)化分析表明龍眼DlTRF2-like與阿月渾子PvTRF2-like親緣關(guān)系最近。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)DlTRF2-like基因在‘四季蜜’龍眼不同組織及乙烯利和多效唑處理后不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明：DlTRF2-like在龍眼不同組織中均有表達(dá)，在花芽中表達(dá)量最高;乙烯利和多效唑處理后，DlTRF2-like基因的表達(dá)量明顯高于對(duì)照，推測(cè)DlTRF2-like響應(yīng)乙烯利和多效唑信號(hào)促進(jìn)龍眼成花。

關(guān)鍵詞：龍眼;MYB-related;龍眼成花;TRF-like亞家族;表達(dá)模式分析

中圖分類號(hào)：S667.2 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： The TRF2-like gene of MYB-related family was cloned from the mature leaves of longan and named DLTRF2-like. Bioinformatics and the expression pattern of DLTRF2-like were analyzed. DLTRF2-like gene belongs to the TRF-like subfamily of MYB-related family， with an ORF length of 909 bp， encoding a protein of 302 amino acids which was predicted to be located in the nucleus. Evolution analysis of homologous genes indicated that DLTRF2-like was most closely related to PvTRF2-like in Pistacia vera L. The expression pattern of DLTRF2-like in different tissues and leaves treated by ethephon and paclobutrazol was analyzed by real-time quantitative PCR. The results showed that DLTRF2-like was expressed in all the samples， and the highest expression level was found in flower buds. The expression level of DLTRF2-like gene in the leaves treated by ethephon and paclobutrazol was significantly higher than that of the control. The results indicated that DLTRF2-like might response to ethephon and paclobutrazol signal to promote the flowering of longan.

Keywords： longan; MYB-related; longan flowering; TRF-like subfamily; expression pattern analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.012

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是無(wú)患子科龍眼屬常綠果樹(shù)，在我國(guó)栽培歷史悠久。廣西是龍眼主產(chǎn)地之一，采收期在7月中下旬至8月下旬。產(chǎn)期過(guò)于集中是我國(guó)龍眼生產(chǎn)面臨的主要問(wèn)題之一，為了有效調(diào)節(jié)龍眼產(chǎn)期，提高龍眼生產(chǎn)效益，生產(chǎn)上多采用修剪和化學(xué)調(diào)控等方法促進(jìn)龍眼成花。化學(xué)調(diào)控主要采用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和氯酸鉀誘導(dǎo)龍眼成花，但是不同品種及不同地區(qū)的調(diào)控效果存在差異?！募久邸梢荒甓啻纬苫?，常出現(xiàn)花果同期現(xiàn)象，生產(chǎn)上常用乙烯利、多效唑等處理，調(diào)控‘四季蜜’龍眼成花坐果時(shí)間。因此，解析龍眼成花的分子調(diào)控機(jī)制具有重要的理論和生產(chǎn)意義。

MYB轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生長(zhǎng)代謝和細(xì)胞形態(tài)建成等生物學(xué)過(guò)程，在植物響應(yīng)逆境脅迫[1-5]、花色素苷合成[6-7]、調(diào)控開(kāi)花時(shí)間[8]等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)高度保守的結(jié)構(gòu)域的特征，可將MYB轉(zhuǎn)錄因子分為4個(gè)亞類，1R-MYB（MYB-related）、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB（4個(gè)R1/R2的重復(fù)）。1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子亞類，是重要的端粒結(jié)合蛋白，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用[9]。MYB-related家族可劃分為5個(gè)亞家族：CAA1-like/R-R、TBP-like、CPC-like、I-BOX-like和TRF-like。各亞家族結(jié)構(gòu)高度保守，其中CAA1-like/R-R亞家族成員結(jié)構(gòu)均含有1個(gè)保守的氨基酸基序（SHAQK（Y/F）F）;TBP-like亞家族成員結(jié)構(gòu)均含有1個(gè)LKDKW（R/K）（N/T）基序;CAA1-like/R-R和TBP-like亞家族都含有紅藻同源基因且最古老，而CPC-like和I-BOX- like亞家族在被子植物中才形成;其中CPC-like是從2R-MYB類的R3重復(fù)區(qū)域演化而來(lái)，I-BOX-like則是從含有2個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的R-R類型的第一個(gè)MYB重復(fù)區(qū)域演化而來(lái);TRF-like亞家族在進(jìn)化過(guò)程中非常保守，且數(shù)量最少。

端粒結(jié)合蛋白TRF（telomere repeat binding factor， TRF）在人和動(dòng)物中的功能研究較多，端粒結(jié)合蛋白TRF1、TRF2（telomere repeat-binding factor， TRF）與抑制因子激活蛋白R(shí)ap1（repressor activator protein 1）、TRF1相互作用的核蛋白2（TRF1-interacting nuclear protein 2， TIN2）、端粒保護(hù)蛋白1（protection of telomeres 1， POT1）和POT1結(jié)合蛋白1（telomere-binding protein POT1- interacting protein 1， TPP1）形成復(fù)合物，參與維持端粒DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和損傷修復(fù)、細(xì)胞的衰老凋亡、增殖和分化等[10]。TRF1和TRF2均以同源二聚體的形式結(jié)合到端粒雙鏈DNA的YTAGGGTTR序列。TRF2和Ku70相互作用可以抑制端粒重組[11]。在擬南芥、水稻和玉米中，端粒長(zhǎng)度與開(kāi)花時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，端粒越長(zhǎng)，開(kāi)花更早[12]。在擬南芥中，TRB通過(guò)結(jié)合telobox基序招募PRC2（polycomb repressive complexes）到靶基因介導(dǎo)H3K27me3表觀修飾[13]。在植物春化過(guò)程中PRC2與VIN3（vernalization insensitive 3）共同參與開(kāi)花抑制基因FLC的表觀沉默，從而促進(jìn)植物開(kāi)花[14]。

為探索龍眼DlTRF2-like基因在成花調(diào)控中的生物學(xué)功能，本研究以龍眼葉片為材料克隆該基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析DlTRF2-like基因在‘四季蜜’龍眼不同組織及乙烯利和多效唑處理后不同時(shí)期的表達(dá)，為深入探索DlTRF2-like基因在龍眼成花過(guò)程中的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 ? 材料與方法

1.1 ?材料

在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院龍眼園基地采集‘四季蜜’龍眼的根、莖、葉片、葉柄、花芽、果肉、果皮和種子等8個(gè)不同組織的樣品，‘四季蜜’龍眼噴施乙烯利和多效唑[15]后0、1、8、15、22（開(kāi)花）、29、36、43 d等8個(gè)不同時(shí)期的葉片，以清水處理為對(duì)照。采樣后擦拭葉片表面灰塵后，迅速置于液氮中速凍備用，各處理3次重復(fù)。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 ?樣品總RNA用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量，cDNA第一鏈的合成使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTM RT Reagent Kit（Takara），隨后將產(chǎn)物置于–20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?‘四季蜜’龍眼DlTRF2-like基因的克隆 ?根據(jù)已公布的龍眼基因組信息，設(shè)計(jì)DlTRF2-like基因引物kl-DlTRF2-like F、kl-DlTRF2-like R1、kl-DlTRF2-like R2（表1），以合成的cDNA第一鏈為模板，采用Prime star Max Premix 2X高保真酶（Takara）進(jìn)行ORF全長(zhǎng)擴(kuò)增。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確的條帶使用試劑盒Gel Extraction Kit（Takara）回收，回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序，獲得DlTRF2-like基因的序列信息[16]。

1.2.3 ?DlTRF2-like蛋白的生物信息學(xué)分析 ?利用NCBI-CDS在線軟件預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域，使用軟件MEGA 5.0鄰近相接法（neighbour joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，DNAMAN V6軟件進(jìn)行同源基因的多重序列比對(duì)。通過(guò)在線軟件（http：//www. soft-berry.com/berry.phtml？topic=index&group= programs &subgroup=proloc）對(duì)DlTRF2-like進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.4 ?龍眼DlTRF2-like基因的表達(dá)分析 ?DlTRF2- like基因的相對(duì)表達(dá)量，采用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）在LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（roche， switzerland）檢測(cè)。反應(yīng)程序如下95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min進(jìn)行溶解，50 ℃冷卻30 s。以ActinF、ActinR為內(nèi)參基因，3次重復(fù)，相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2–ΔΔCT法[17]。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ?DlTRF2-like基因的序列分析及和多重序列比對(duì)

‘四季蜜’龍眼DlTRF2-like基因ORF長(zhǎng)度為909 bp（圖1），編碼的蛋白含有302個(gè)氨基酸殘基（圖2）。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明，DlTRF2-like蛋白屬于SANT-TRF/Myb-related超家族，在多肽鏈的N端存在Myb-related結(jié)合位點(diǎn)（圖3），且存在含有SANT/MYB-like家族的端粒重復(fù)結(jié)合因子DNA結(jié)合域SANT_TRF，通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)DlTRF2-like蛋白定位在細(xì)胞核。

使用軟件DNAMAN V6對(duì)龍眼DlTRF2-like和其他物種同源基因進(jìn)行多重氨基酸序列比對(duì)（圖4），發(fā)現(xiàn)龍眼DlTRF2-like中含有MYB- related基因家族典型保守序列LKDKWRN，確定該序列為MYB-related基因家族中的一員。

2.2 ?構(gòu)建龍眼DlTRF2-like蛋白質(zhì)進(jìn)化樹(shù)

將龍眼DlTRF2-like蛋白與NCBI中相似度較高的14種植物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建與分析[阿月渾子（Pistacia vera）PvTRF2-like（XP_ 031272926.1）、柑橘（Citrus sinensis）CsTRF2（XP_006466449.1）、克萊門柚（Citrus clementina） CcTRF2（XP_006426109.1）、橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）HbTRF2-like（XP_021682630.1）、美洲櫟（Quercus lobata）QlTRF2（XP_030975007.1）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）GrTRF2-like（XP_012491976.1）、棗（Ziziphus jujuba）ZjTRF2- like（XP_015890310.1）、栓皮櫧（Quercus suber）QsTRF2（XP_023919472.1）、陸地棉（Gossypium hirsutum）GhTRF2-like（XP_016697329.1）、可可（Theobroma cacao）TcTRF2（XP_007047553.1）、木薯（Manihot esculenta）MeTRF2-like（XP_ 021630908.1）、核桃（Juglans regia）JrTRF2-like（XP_035539599.1）、甜櫻桃（Prunus avium）PaTRF2（XP_021805532.1）、榴蓮（Durio zibethinus）DzTRF2-like（XP_022740061.1）。發(fā)現(xiàn)龍眼DlTRF2-like蛋白與阿月渾子PvTRF2- like的親緣關(guān)系最接近，其次是柑橘CsTRF2和克萊門柚CcTRF2，它們的功能可能更為相似（圖5）。

2.3 ?DlTRF2-like基因的表達(dá)分析

2.3.1 ?DlTRF2-like基因‘四季蜜’龍眼不同組織中的表達(dá) ?實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明（圖6），DlTRF2-like基因在‘四季蜜’龍眼不同組織中的表達(dá)存在顯著性差異，DlTRF2-like基因在花芽中的表達(dá)量最高，是根中表達(dá)量的8倍;其次是葉柄，表達(dá)量約為根中的6倍;然后是葉片，表達(dá)量是根中的3.3倍，DlTRF2-like基因在莖、果肉、果皮和種子的表達(dá)量與根相近，說(shuō)明DlTRF2-like基因主要在‘四季蜜’龍眼的葉片和花芽中發(fā)揮重要功能。

2.3.2 ?噴施乙烯利和多效唑的葉片中DlTRF2- like基因的表達(dá)情況 ?噴施乙烯利和多效唑后DlTRF2-like基因的表達(dá)量與對(duì)照存在較大差異（圖7），噴施乙烯利和多效唑后的表達(dá)量明顯高于同時(shí)期的清水對(duì)照，說(shuō)明噴施乙烯利和多效唑可以誘導(dǎo)DlTRF2-like基因在‘四季蜜’龍眼葉片中的表達(dá)。噴施乙烯利和多效唑后15 d，DlTRF2-like基因表達(dá)量最高，其次是43 d。DlTRF2-like基因在開(kāi)花前的0、1、8 d表達(dá)量相近，在15 d表達(dá)量迅速上升至3倍，噴施乙烯利和多效唑后22 d開(kāi)花，而清水對(duì)照未開(kāi)花，且22 d表達(dá)量下降至1倍水平，說(shuō)明DlTRF2-like基因在臨近開(kāi)花時(shí)起重要作用。43 d末花期表達(dá)量增高原因暫時(shí)不明確。

3 ?討論

本研究獲得了龍眼DlTRF2-like基因，DlTRF2-like屬于TRF-like亞家族，全長(zhǎng)909 bp，編碼302個(gè)氨基酸，含有一個(gè)Myb-related保守結(jié)構(gòu)域LKDKWRN。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示DlTRF2-like蛋白定位于細(xì)胞核中。NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)龍眼DlTRF2-like與阿月渾子PvTRF2-like的親緣關(guān)系最接近，其次是柑橘CsTRF2和克萊門柚CcTRF2，目前暫無(wú)阿月渾子PvTRF2-like、柑橘CsTRF2和克萊門柚CcTRF2功能相關(guān)報(bào)道，龍眼DlTRF2-like基因功能有待進(jìn)一步分析。

PcG（polycomb group）介導(dǎo)的表觀修飾在動(dòng)植物的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。擬南芥PcG與PWO1（pwwp domain interactor of polycombs1）相互作用調(diào)控開(kāi)花和發(fā)育[18]。在擬南芥中TRB可以結(jié)合telobox基序，并與PcG的核心催化酶CLF（curly leaf）和SWN（swinger）相互作用，招募PRC2介導(dǎo)靶基因的表觀修飾[13]。

多效唑和乙烯利具有抑制果樹(shù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和促進(jìn)成花的作用[19-20]。在龍眼栽培中，乙烯利有明顯的促花和增加開(kāi)花數(shù)的作用，高濃度乙烯利（CEPA）能在冬季有效地調(diào)控龍眼冬梢促進(jìn)花芽分化，低濃度乙烯利在龍眼花序迅速分花期（2月下旬）使用能使多年不開(kāi)花的成年樹(shù)開(kāi)花結(jié)果[21]。熱帶生態(tài)型龍眼‘四季蜜’是一個(gè)易于調(diào)控成花的龍眼品種，噴施多效唑和乙烯利具有調(diào)控其成花的作用，且使用濃度范圍較廣，多種濃度組合以及不同施用次數(shù)都能促進(jìn)開(kāi)花[15]。本研究分析了‘四季蜜’龍眼不同組織中DlTRF2-like基因表達(dá)，結(jié)果顯示它在花芽中表達(dá)量最高，其次是葉柄、葉片。有研究發(fā)現(xiàn)MdFT基因在蘋果花、葉片和幼果中的表達(dá)均高于種子等其他組織[22]，桑樹(shù)MaFT基因在成熟葉的表達(dá)高于花、果實(shí)、嫩葉、腋芽頂芽等組織[23]。而FT基因在植物花形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用[24]，故推測(cè)龍眼DlTRF2- like基因可能在‘四季蜜’龍眼花芽中發(fā)揮重要作用。根據(jù)定量結(jié)果，DlTRF2-like基因在噴施乙烯利和多效唑的表達(dá)量明顯高于在清水對(duì)照中的表達(dá)量，說(shuō)明該基因可能參與乙烯利和多效唑促進(jìn)龍眼成花調(diào)控，促進(jìn)花芽分化。但該基因具體作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究證明。

參考文獻(xiàn)

[1] Zhao P C， Hou S L， Guo X F， et al. A MYB-related tran-scription factor from sheepgrass， LcMYB2， promotes seed germination and root growth under drought stress[J]. BMC Plant Biology， 2019， 19（14）： 237-251.

[2] Yin X M， Cui Y C， Wang M L， et al. Overexpression of a novel MYB-related transcription factor， OsMYBR1， confers improved drought tolerance and decreased ABA sensitivity in rice[J]. Biochemical and Biophysical Research Commu-nications， 2017， 490（4）： 1355-1361.

[3] Cheng L Q， Li X X， Huang X， et al. Overexpression of sheepgrass R1-MYB transcription factor LcMYB1 confers salt tolerance in transgenic arabidopsis[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2013， 70： 252-260.

[4] Li T， Sun J K， Bi Y P， et al. Overexpression of an MYB- Related Gene FvMYB1 from Fraxinus velutina increases to-lerance to salt stress in transgenic tobacco[J]. Plant Growth Regulation， 2016， 35（3）： 632-645.

[5] Xiong H Y， Li J J， Liu P L， et al. Overexpression of Os-MYB48-1， a novel MYB-Related transcription factor， en-hances drought and salinity tolerance in rice[J]. PloS One， 2014， 9（3）： e92913.

[6] Aly R， Lati R， Bari V K， et al. Use of a visible reporter marker-myb-related gene in crop plants to minimize herbi-cide usage against weeds[J]. Plant Signaling & Behavior， 2019， 14（4）： e1581558.

[7] Kobayashi S， Ishimaru M， Hiraoka K， et al. Myb-related genes of the Kyoho grape （Vitis labruscana） regulate antho-cyanin biosynthesis[J]. Planta， 2002， 215（6）： 924-933.

[8] Zhang L C， Liu G X， Jia J Z， et al. The wheat MYB-related transcription factor TaMYB72 promotes flowering in rice [J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2016， 58（8）： 701- 704.

[9] 杜 ?海. 植物MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的分子進(jìn)化機(jī)制及調(diào)控類黃酮生物合成MYB基因的鑒定[D]. 雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.

[10] Titia D L. Shelterin： The protein complex that shapes and safeguards human telomeres[J]. Genes & development， 2005， 19（18）： 2100-2110.

[11] Song K， Jung D， Jung Y S， et.al. Interaction of human Ku70 with TRF2[J]. FEBS Letters， 2000， 481： 81-85.

[12] Young C J， Abdulkina L R， Yin J， et al. Natural variation in plant telomere length is associated with flowering time[J]. Plant Cell， 2021， 33（4）： 1118-1134.

[13] Zhou Y， WangY J， Krause K， et al. Telobox motifs recruit CLF/SWN–PRC2 for H3K27me3 deposition via TRB factors in Arabidopsis[J]. Nature Genetics， 2018， 50（5）： 638-644.

[14] Zhao Y， Antoniou-Kourounioti R L， Calder G， et al. Tem-perature-dependent growth contributes to long-term cold sensing[J]. Nature， 2020， 583： 825-829.

[15] 朱建華， 黃鳳珠， 徐 ?寧， 等. ‘四季蜜’龍眼成花調(diào)控技術(shù)研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2011， 27（25）： 288-293.

[16] 李 ?琳， 丁 ?峰， 潘介春， 等. 龍眼DlZAT10基因克隆與植物超表達(dá)載體構(gòu)建[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2021， 42（1）： 33- 39.

[17] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene ex-pression data using real-time quantitative PCR and the 2 （-delta delta C （T）） method. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[18] Hohenstatt M L， Mikulski P， Komarynets O， et al. PWWP- DOMAIN INTERACTOR OF POLYCOMBS1 interacts with Polycomb-group proteins and histones and regulates Arabidopsis flowering and development[J]. Plant Cell， 2018， 30（1）： 117-133.

[19] 葉明兒. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在果樹(shù)上的應(yīng)用[M]. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2011.

[20] 盧美英， 徐炯志， 歐世金， 等. 荔枝龍眼杧果沙田柚控梢促花保果綜合調(diào)控技術(shù)[M]. 北京： 金盾出版社， 2009.

[21] 陳香玲. 乙烯利對(duì)龍眼成花的生理生化作用研究[D]. 南寧： 廣西大學(xué)， 2005.

[22] 鄭小一， 王三紅， 張計(jì)育， 等. 蘋果FT同源基因MdFT的表達(dá)特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2011， 27（2）：390-395.

[23] 李四軍. 桑樹(shù)FT基因的克隆及表達(dá)分析[D]. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2013.

[24] 張 ?婧. 高等植物開(kāi)花基因FT研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2012（3）： 31-32.

責(zé)任編輯：沈德發(fā)