蘇群 田敏 李春牛 李先民 盧家仕 黃展文 李杰梅 卜朝陽 王虹妍

摘 ?要：睡蓮葉片胎生現(xiàn)象是繁育途徑的重要補(bǔ)充，對種群的傳播、擴(kuò)散和生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性有重要作用。通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選和分析睡蓮葉片胎生現(xiàn)象相關(guān)的代謝路徑和調(diào)控基因，為深入認(rèn)識睡蓮葉片胎生發(fā)育的分子機(jī)制提供參考。以葉片具有胎生現(xiàn)象的‘小花睡蓮’（X）和葉片無胎生現(xiàn)象的‘藍(lán)星睡蓮’（L）為材料，利用RNA-Seq技術(shù)對葉片4個發(fā)育階段的葉臍部分進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分析對照（L）和樣品（X）葉片不同發(fā)育階段測序結(jié)果：篩選出的差異表達(dá)基因（DEGs）中，34 909個基因（48.65%）表達(dá)上調(diào)，36 850個基因（51.35%）表達(dá)下調(diào)。DEGs分析顯示，隨著葉片的發(fā)育，X和L上調(diào)基因和下調(diào)基因數(shù)均呈增加趨勢。對L1-vs-X1、L4-vs-X4階段的GO和KEGG功能富集分析表明，DEGs主要富集在質(zhì)膜和膜相關(guān)成分、胞外區(qū)域、細(xì)胞壁等相關(guān)的細(xì)胞組分中，涉及到代謝過程、生物合成和應(yīng)急響應(yīng)等;Pathway代謝通路表明，DEGs主要參與到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷類生物合成、氨基酸類代謝、類黃酮生物合成、甘油磷脂類代謝以及細(xì)胞周期相關(guān)等過程。對DEGs進(jìn)一步分析，克隆出了4個可能參與睡蓮葉片胎生發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子。

關(guān)鍵詞：睡蓮;葉片胎生;轉(zhuǎn)錄組分析;差異表達(dá)基因;代謝通路

中圖分類號：Q949.746.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Leaf vivipary in water lily （Nymphaea） is an important supplement to breeding， which plays an important role in the propagation and adaptability of species. Transcriptome sequencing technology was used to screen and explore genome-wide analysis of regulatory genes and metabolic pathways involved in leaf vivipary in water lily. This study would lay a foundation for further understanding the molecular mechanism of leaf viviparous development. Viviparous N. micrantha （X） and non-viviparous N. colorata （L） were selected as the experimental materials. By using RNA-Seq technology， four stages of leaf development of the leaf stalk and stem and stem join were tested and analyzed using a series of bioinformatics analysis. The result showed that 34 909 （48.65%） DEGs were up-regulated and 36 850 （51.35%） DEGs were down-regulated. DEGs analysis showed that up-regulated genes and down-regulated genes both increased with the leaves development of N. micrantha amd N. colorata. GO and KEGG enrichment analysis of L1-vs-X1 and L4-vs-X4 stage showed that DEGs were mainly enriched in plasmalemma， cytomembrane and extracellular domain cytoderm associated with ?metabolic process， biosynthesis and stimulus response. Pathway metabolism pathways indicated that DEGs were mainly involved in plant hormone signal transduction， phenylpropanoid biosynthesis， amino acids metabolism， flavonoid biosynthesis， glycerolipid metabolism and cell cycle and other processes. Four transcription factors potentially involved in leaf viviparous development of water lily were cloned based on DEGs analysis.

Keywords： water lily; leaf vivipary; transcriptome sequencing; DEGs; metabolic pathway

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.009

睡蓮為睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea L.）多年生草本植物，花色豐富，花期長，適應(yīng)性與抗逆性強(qiáng)，栽培容易且分布廣泛[1]。睡蓮屬為睡蓮科中最大的屬，約50余種（含變種），可分為subg. Nymphaea、subg. Anecphya、subg. Brachyceras、subg. Hydrocallis和subg. Lotos 5個亞屬[2-3]。睡蓮因其極高的觀賞價值和在植物進(jìn)化、分類中的重要地位而越來越受到愛好者、育種家和植物學(xué)家的追捧[4-7]。部分熱帶睡蓮的葉片除進(jìn)行光合作用外，還具有葉片胎生（vivipary）的特性，在其葉臍部位（葉片與葉柄連接處）長出新的植株[1]。胎生是植物另一種繁殖途徑，可使其種群在較短時間內(nèi)快速傳播和擴(kuò)散，更易適應(yīng)多變而復(fù)雜的自然環(huán)境，此外胎生對生物多樣性保護(hù)，生態(tài)平衡的發(fā)展具有重要意義[8]。與睡蓮葉片胎生現(xiàn)象相關(guān)的內(nèi)部代謝路徑和調(diào)控基因的研究則鮮見報道。

本研究利用Illumina測序平臺，以葉片具有胎生現(xiàn)象的‘小花睡蓮 ’（Nymphaea micrantha， X）和葉片無胎生現(xiàn)象的‘藍(lán)星睡蓮’（Nymphaea col-orata， L）為材料，對葉片4個發(fā)育階段的葉臍部分進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并重點比對分析了L1-vs-X1和L4-vs-X4階段的差異表達(dá)基因和代謝通路富集，以期篩選睡蓮葉片不同發(fā)育模式下的相關(guān)代謝路徑和參與葉片胎生發(fā)育的調(diào)控基因，為睡蓮葉片胎生發(fā)育的分子遺傳機(jī)制研究提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

‘小花睡蓮’（X）和‘藍(lán)星睡蓮’（L）均種植于廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所睡蓮資源圃內(nèi)，采用缸栽形式，水缸尺寸為口徑85 cm，深度50 cm，水深常年維持在25 cm左右。取‘X’（樣品）葉片和‘L’（對照）葉片4個不同發(fā)育階段的葉臍部位為材料（圖1），將相同基因型的材料6株混合取樣，并重復(fù)取樣1次。取樣后迅速放入液氮中保存。

1.2 ?方法

1.2.1 ?RNA提取、文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序 ?委托攸歸（上海）生物科技有限公司完成RNA提取、文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序工作。采用CTAB法提取睡蓮總RNA并采用Agilent 2100進(jìn)行質(zhì)檢。RNA樣品檢測合格后，富集并打斷成短片段，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs、DNA polymerase I和RNase H合成二鏈cDNA，隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫。采用Illumina NovaSeq 6000平臺進(jìn)行雙末端測序。

使用NGS QC Toolkit[9]軟件對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控以得到高質(zhì)量的clean reads。使用hisat2[10]將clean reads與‘藍(lán)星睡蓮’的參考基因組進(jìn)行比對（ftp：//download.big.ac.cn/gwh/Plants/ Nymphaea_colorata_Nym_GWHAAYW00000000/ GWHAAYW00000000.genome.fasta.gz），比對結(jié)

果以二進(jìn)制binary文件即bam文件進(jìn)行儲存。之后使用Cufflinks[11]對基因定量獲取FPKM值。采用htseq-count[12]軟件獲取落到各個樣本中基因的reads數(shù)目。

1.2.2 ?差異表達(dá)基因（DEGs）檢測、功能注釋和富集分析 ?使用STEM （Short Time-series Ex-pression Miner）軟件對不同發(fā)育階段的睡蓮葉片中基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。并采用R中的pheatmap函數(shù)進(jìn)行熱圖聚類分析。使用DESeq （2012） Rpackage的estimateSizeFactors函數(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并使用nbinomTest函數(shù)計算差異比較的P value和fold change值。以P<0.05且fold change值2倍以上（上調(diào)或下調(diào)）作為篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)。利用Blast2GO[12]軟件和KAAS軟件（https：//www.genome.jp/tools/kaas/）分別進(jìn)行GO和KEGG[13]注釋和富集分析。重點選擇比對了L1-vs-X1、L4-vs-X4階段基因的差異表達(dá)情況，統(tǒng)計同種材料不同時期和不同材料同一時期轉(zhuǎn)錄組的DEGs，并進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以判定差異基因主要影響的代謝途徑和信號通路。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?總RNA質(zhì)量檢測和組裝結(jié)果分析

‘小花睡蓮’葉片和‘藍(lán)星睡蓮’葉片4個不同發(fā)育階段總計16份樣本，經(jīng)檢測，樣品總RNA質(zhì)量達(dá)到建庫要求，其中濃度為70～1230 ng/μL，A260/280為2.1～2.2，28S/18S為1.1～1.9，RIN≥7。

轉(zhuǎn)錄組測序共獲得134.97 Gb原始數(shù)據(jù)（表1），各樣本Q30值達(dá)到94%以上，GC≥49%，說明測序結(jié)果準(zhǔn)確度較好，可用于后續(xù)分析。

2.2 ?轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析

為了分析‘小花睡蓮’和‘藍(lán)星睡蓮’睡蓮葉片轉(zhuǎn)錄組中基因表達(dá)差異情況，做了全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)基因熱圖。從圖2可看出，‘小花睡蓮’和‘藍(lán)星睡蓮’中不同發(fā)育階段的葉片中基因表達(dá)差異較為明顯，L1-vs-X1、L4-vs-X4階段有著較為顯著的差異表達(dá)基因。同時進(jìn)一步分析‘小花睡蓮’和‘藍(lán)星睡蓮’葉片中不同表達(dá)基因的時空表達(dá)模式，利用STEM軟件對‘小花睡蓮’和‘藍(lán)星睡蓮’8個組織進(jìn)行了基因表達(dá)趨勢（Profile）分析。結(jié)果顯示共檢測到60個表達(dá)趨勢，其中‘小花睡蓮’和‘藍(lán)星睡蓮’各30個（圖3）。在‘小花睡蓮’4個發(fā)育階段葉片中，表達(dá)趨勢8、12、4、18、0、14、25、13、21是顯著富集（P<0.05），分別包含2337、1302、1254、1157、1008、953、913、662、643個表達(dá)基因;在‘藍(lán)星睡蓮’4個發(fā)育階段葉片中，表達(dá)趨勢4、8、25、0、21、12是顯著富集（P<0.05），分別包含了3773、1919、1491、1153、838、675、530個表達(dá)基因。這些基因的大量表達(dá)，提示它們在此發(fā)育階段發(fā)揮重要作用。

2.3 ?差異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)分析

如表2所示，在檢測到的DEGs中，上調(diào)差異基因34 909個（48.65%），下調(diào)差異基因36 850個（51.35%）。隨著葉片的發(fā)育，‘小花睡蓮’和‘藍(lán)星睡蓮’上調(diào)基因和下調(diào)基因數(shù)均呈增加趨勢，各階段比對分析顯示，L1-vs-X1階段的DEGs為5559個，其中2033個基因表現(xiàn)為上調(diào)，3526個基因表現(xiàn)下調(diào)，下調(diào)基因數(shù)明顯多于上調(diào)基因數(shù);L4-vs-X4階段的DEGs最多，高達(dá)7391個，其中2979個基因上調(diào)，4412個基因下調(diào)，同樣也是下調(diào)基因多于上調(diào)基因。L1-vs-X1和L4-vs-X4的DEGs韋恩圖分析表明，3507個DEGs在2個比對階段皆有表達(dá)，3884個DEGs在L4-vs-X4中差異表達(dá)，2052個DEGs在L1-vs-X1中表達(dá)（圖4）。根據(jù)試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)結(jié)果初步推測3884個基因中可能存在睡蓮葉片胎生發(fā)育相關(guān)的基因。

2.4 ?差異表達(dá)基因的GO功能分析

為了進(jìn)一步了解睡蓮葉片胎生發(fā)育分子機(jī)制，重點分析了L1-vs-X1階段的5559個DEGs以及L4-vs-X4階段的7391個DEGs的GO富集分析top30（篩選3種分類中對應(yīng)基因數(shù)目大于2的GO條目，按照每個條目對應(yīng)的-log10 P value由大到小排序的各前10條）。從圖5可知，DEGs在L1-vs-X1及L4-vs-X4階段均主要富集在細(xì)胞組分中，具體到質(zhì)膜和膜相關(guān)成分、核小體、類囊體、胞外區(qū)域、細(xì)胞壁等的細(xì)胞組分中，涉及到代謝過程、生物合成等;在生物過程中，較多的DEGs歸類為次生代謝、光合呼吸反應(yīng)、防衛(wèi)反應(yīng)、鐵離子運(yùn)輸、應(yīng)急響應(yīng)及DNA復(fù)制和修復(fù)等;在分子功能分類中，參與結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和催化活性的DEGs最多。

2.5 ?差異表達(dá)基因的KEGG功能分析

KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫，可以利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異Unigene進(jìn)行Pathway富集分析（結(jié)合KEGG注釋結(jié)果）。L1-vs-X1階段以及L4-vs-X4階段的KEGG富集分析top20（以P≤0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，同時過濾掉差異基因數(shù)目小于3的條目）如表3～表4所示。Pathway代謝通路表明DEGs主要參與到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷類生物合成、氨基酸類代謝、細(xì)胞周期、光合作用、類黃酮生物合成以及磷脂類代謝等相關(guān)過程。

L1-vs-X1階段植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集DEGs最多達(dá)到17個，7個基因表達(dá)上調(diào)，10個基因下調(diào)表達(dá);其次，光合作用固碳路徑中有8個基因上調(diào)，2個基因下調(diào);氨基酸代謝路徑富集9個DEGs，6個基因上調(diào)，3個基因表達(dá)下調(diào);磷脂類代謝及葉綠色代謝類路徑各有8個DEGs，此外囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)互作路徑、DNA復(fù)制、類胡蘿卜素生物合成等路徑DEGs均達(dá)到了5個。L4-vs-X4階段植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集DEGs最多達(dá)18個，其中7個基因表達(dá)上調(diào)，11個基因表達(dá)下調(diào);苯丙烷生物合成富集DEGs 15個，12個基因表達(dá)上調(diào)，3個基因表達(dá)下調(diào);重點指出的是參與細(xì)胞周期-減數(shù)分裂相關(guān)的DEGs多達(dá)35個，其中22個基因上調(diào)，13個基因下調(diào)。此外，甘油磷脂類代謝路徑DEGs有10個，上調(diào)和下調(diào)表達(dá)基因各有5個;富集參與到脂肪酸代謝、類黃酮代謝、類固醇激素代謝及葉綠素代謝通路的DEGs也較多。綜上可知，L1-vs-X1階段及L4-vs-X4階段的植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集DEGs都是最多，且下調(diào)基因數(shù)多于上調(diào)基因數(shù)。

2.6 ?激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中顯著差異表達(dá)基因的篩選

為了探尋參與睡蓮葉片胎生的內(nèi)部調(diào)控機(jī)制的基因，通過重點分析‘小花睡蓮’和‘藍(lán)星睡蓮’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選‘小花睡蓮’顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子，并通過轉(zhuǎn)錄組reads組裝獲得基因全長。

以此為基礎(chǔ)，設(shè)計相關(guān)基因擴(kuò)增引物，通過PCR克隆方法，得到4個轉(zhuǎn)錄因子基因，分別為ERF1B（NCBI登錄號：MT542693）、ERF105（NCBI登錄號：MT974544）、RAP2-3（NCBI登錄號：MT799791）和WRKY22（NCBI登錄號：MT 799792）。

3 ?討論

葉片通常被認(rèn)為是植物進(jìn)行光合作用、呼吸作用和蒸騰作用的主要場所，部分葉片也具有觀賞價值和營養(yǎng)價值[14]。一些植物葉片還能夠從葉緣或者葉片中央部位長出新的完整植株，如伽藍(lán)菜屬的大葉落地生根（Kalanchoe daigremontiana）[15]和睡蓮屬（Nymphaea spp.）的一些種（品種）[1， 8]等。葉片、花朵等植物營養(yǎng)器官的胎生是植物另一種繁殖途徑，可使其種群在較短時間內(nèi)快速傳播和擴(kuò)散，更易適應(yīng)復(fù)雜而多變的自然環(huán)境。此外胎生對生物多樣性保護(hù)及生態(tài)平衡的發(fā)展具有重要意義，這種胎生能力受內(nèi)部基因的調(diào)控，具有可遺傳性，植物通過這種方式可將進(jìn)化的優(yōu)良性狀一代代遺傳固定下來[8]。部分熱帶睡蓮也多以葉胎生的形式繁殖，但其形態(tài)發(fā)育和分子水平的內(nèi)部調(diào)控的機(jī)理尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

本研究中L1-vs-X1和L4-vs-X4階段的植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集的DEGs都最多，說明在調(diào)控睡蓮葉片胎生苗發(fā)育過程中，植物激素信號一直發(fā)揮著重要作用，這與Kane等[16]探討植物激素對睡蓮胎生苗的研究的結(jié)果一致。在L1-vs-X1階段上調(diào)基因7個，下調(diào)基因10個;L4-vs-X4階段上調(diào)基因7個，下調(diào)基因11個，2個比對階段均有較多的上下調(diào)基因，維持著動態(tài)平衡。此外通過胎生和非胎生睡蓮種間轉(zhuǎn)錄組的比較試驗，發(fā)現(xiàn)生長素（AUX/IAA）、生長素應(yīng)答因子（ARF）、植物生長素酰胺合成酶（GH3）和生長素上調(diào)小RNA（SAUR）的顯著差異調(diào)節(jié)。Aux/IAA是早期反應(yīng)基因，能夠精確快速地觸發(fā)基因重編程[17]。ARF轉(zhuǎn)錄因子在生長素感知時被激活，并啟動下游信號通路，包括SAUR基因。SAURs調(diào)節(jié)許多生長素介導(dǎo)的反應(yīng)，特別是通過細(xì)胞伸長的組織生長[18]。這些基因可能通過參與細(xì)胞分裂、擴(kuò)大和分化而直接參與睡蓮胎生外部生長的發(fā)育[17]。生長素與細(xì)胞因子的結(jié)合也有助于細(xì)胞分化，細(xì)胞分裂素（CRE）的高表達(dá)可能是胎生細(xì)胞分化的原因之一，因為其對莖頂端分生組織的活性是已知的[19]。此外，有研究表明其他激素如乙烯等和IAA的互作來調(diào)控胎生苗根系的發(fā)育[20]。郭書磊等[21]利用RNA-Seq技術(shù)研究玉米葉片形態(tài)建成也得出多種植物激素相互作用通過參與調(diào)控玉米葉片寬窄的形態(tài)建成研究相同。綜上所述，植物激素間的相互作用和動態(tài)平衡對睡蓮葉片胎生發(fā)育有著重要的影響。

隨著近年鄉(xiāng)村振興和休閑旅游的興起，睡蓮因其迷人的外表而得到快速的推廣應(yīng)用，但性狀優(yōu)良的睡蓮品種往往不具有胎生能力，種苗繁育困難，導(dǎo)致價格居高不下，嚴(yán)重制約了其進(jìn)一步的推廣應(yīng)用。雖然目前在胎生睡蓮的形態(tài)解剖、分子水平上取得了一些進(jìn)展，但引起胎生現(xiàn)象的內(nèi)部調(diào)控機(jī)制并沒有得到系統(tǒng)解答，仍需進(jìn)一步在分子水平上探究形成機(jī)理和挖掘重要功能基因。轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育及其對外界環(huán)境的反應(yīng)中起著重要調(diào)控作用，其序列和結(jié)構(gòu)的多樣性決定了其功能的多樣性。通過睡蓮種間胎生和非胎生轉(zhuǎn)錄組的比較研究，挖掘出4個顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，分別為ERF1B、ERF105、RAP2-3和WRKY22。通過前人的研究得知AP2/ERF家族有多個成員能夠調(diào)節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生[22]，其中被研究得最多的是BABY BOOM （BBM）基因[23-27]和WOUND INDUCEDDEDIFFERENTI ATION 1 （WIND1）或RAP2.4基因[28]。也有研究表明WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子通過參與其他激素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來間接調(diào)節(jié)植物體細(xì)胞的發(fā)育[29-30]。AP2/ERF基因家族和WRKY等基因家族成員多而復(fù)雜，成員之間的功能差異很大，需具體到特定物種中進(jìn)行功能驗證，如在蘋果中ERF1B基因能夠通過調(diào)控LOX途徑進(jìn)行香氣的合成[31]。而在棉花中則可能參與抗黃萎病的調(diào)控[32]。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組角度分析出植物激素間的相互作用和動態(tài)平衡對睡蓮葉片胎生發(fā)育有著重要的影響，并結(jié)合RT-PCR技術(shù)克隆了ERF1B、ERF105、RAP2-3和WRKY22等4個可能參與葉片胎生過程調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子基因，以期為睡蓮葉片胎生的內(nèi)部代謝和基因調(diào)控提供一定理論基礎(chǔ)，今后還需對克隆出的4個轉(zhuǎn)錄因子作進(jìn)一步的研究探討。

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責(zé)任編輯：黃東杰