赫春青，陳開(kāi)陽(yáng)，師三媛，肖冬光，范志華，劉智永，陳方見(jiàn)

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300380；3.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過(guò)程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

雨生紅球藻（Haematococcus plivialis）是自然界中天然蝦青素含量最高的物種，含量可達(dá)細(xì)胞干重的7%[1]。蝦青素是一種類胡蘿卜素，具有極強(qiáng)的抗氧化能力，其抗氧化能力約為其它類胡蘿卜素的10倍[2]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于其它普通抗氧化物質(zhì)，因而被廣泛應(yīng)用于飼料、保健品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域[3]。但與其它微生物相比，雨生紅球藻光自養(yǎng)培養(yǎng)存在生長(zhǎng)較慢、環(huán)境適應(yīng)能力較差的缺點(diǎn)[4]。在雨生紅球藻生活史中存在多種細(xì)胞形態(tài)，國(guó)際上存在多種分類，劉建國(guó)等[5]則將雨生紅球藻歸納為游動(dòng)與不游動(dòng)狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)在游動(dòng)期間細(xì)胞活力強(qiáng)、繁殖快，受到外界脅迫會(huì)由游動(dòng)形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴挥蝿?dòng)形態(tài)，期間多伴隨蝦青素的積累[3]。目前雨生紅球藻誘導(dǎo)生產(chǎn)蝦青素的方法主要包括營(yíng)養(yǎng)脅迫和光脅迫兩種[6-8]，方法已經(jīng)比較成熟，但雨生紅球藻光自養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢難以達(dá)到很高的培養(yǎng)密度，導(dǎo)致其在大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素過(guò)程中成本較高。

雨生紅球藻培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)鹽使得pH值增長(zhǎng)過(guò)快，當(dāng)pH值達(dá)到一定高度時(shí)會(huì)抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)[9]，因此控制培養(yǎng)基中的pH值對(duì)于提高細(xì)胞密度具有重要作用。雨生紅球藻和植物的生長(zhǎng)類似，它的生長(zhǎng)受激素的調(diào)節(jié)，在培養(yǎng)基中添加一定量的植物激素[10]可促進(jìn)藻細(xì)胞的增殖。雨生紅球藻既可以自養(yǎng)生長(zhǎng)也可以異養(yǎng)生長(zhǎng)，有關(guān)報(bào)道指出，雨生紅球藻可以利用乙酸鈉作為碳源進(jìn)行培養(yǎng)，但乙酸鈉添加量因藻種而異[11-12]。本試驗(yàn)旨在利用發(fā)酵培養(yǎng)代替光自養(yǎng)培養(yǎng)雨生紅球藻，通過(guò)改變培養(yǎng)基成分以及環(huán)境條件提高該藻的培養(yǎng)密度，進(jìn)而降低雨生紅球藻培養(yǎng)的成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻（H.plivialis）NIES-144藻株：日本國(guó)立環(huán)境研究所。硝酸鈣、硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鐵、生物素（均為分析純）：天津市江天化工技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-1NDII超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LI-250A光照強(qiáng)度測(cè)量?jī)x：廣州市宏誠(chéng)集業(yè)電子科技有限公司；GI54DWS高壓蒸汽滅菌鍋：北京艾德萊生物科技有限公司；420P-01A pH計(jì)：梅特勒-托利多國(guó)際有限公司；ZWYR-2112B恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；101-0A鼓風(fēng)干燥箱：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

微量元素儲(chǔ)備液：FeCl3·6H2O 0.196 g/L、MnCl2·4H2O 0.036 g/L、ZnSO4·7H2O 0.022 g/L、CoCl2·6H2O 4 mg/L、Na2MoO4·2H2O 2.5 mg/L、Na2EDTA·2H2O 1 g/L、初始pH值為7.5，121℃滅菌20 min。

C 培養(yǎng)基：Ca（NO3）2·4H2O 0.15 g/L、KNO30.1 g/L、β-甘油磷酸二鈉 0.05 g/L、MgSO4·7H2O 0.04 g/L、微量元素儲(chǔ)備液 3 mL、維生素 B110 μg/L、生物素 0.1 μg/L、維生素B120.1 μg/L、三羥甲基氨基甲烷 [tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]0.5 g/L。

1.3.2 微藻的培養(yǎng)

使用三角瓶在恒溫?fù)u床中間歇振蕩培養(yǎng)，搖床120 r/min振蕩1 min，轉(zhuǎn)速降為30 r/min振蕩20 min，兩種轉(zhuǎn)速間歇運(yùn)行。光照強(qiáng)度為10 μmol/（m2·s），溫度為25℃。定期取樣，分別檢測(cè)細(xì)胞密度、生物量、pH值等數(shù)據(jù)。

1.3.3 初始乙酸鈉濃度的影響

將乙酸鈉按照 0、5、10、15、20、25 mmol/L 的濃度分別加到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后分別取樣檢測(cè)細(xì)胞密度。

1.3.4 初始pH值優(yōu)化

將培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)節(jié)為7.0、7.5、8.0、8.5進(jìn)行培養(yǎng)。每天分別取樣檢測(cè)細(xì)胞密度和pH值。

1.3.5 接種量的影響

將雨生紅球藻分別按照15%、20%、25%、30%的接種量進(jìn)行培養(yǎng)。每天分別取樣檢測(cè)生物量干重。

1.3.6 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

選擇培養(yǎng)時(shí)間、乙酸鈉濃度、初始pH值和接種量4個(gè)因素，各取3個(gè)水平，以L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以得到最優(yōu)的條件組合，設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵條件的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1L9（34）Orthogonal designation of fermentation conditions

1.3.7 不同植物激素的應(yīng)用及組合使用的影響

將植物 3-吲哚丁酸（3-indolebutyric acid，3-IBA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）、萘乙酸（1-naphthylacetic acid，NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-benzyl aminopurine，6-BA）以L9（34）正交法進(jìn)行試驗(yàn)，得出最優(yōu)的激素配比，設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.4 計(jì)算分析

1.4.1 細(xì)胞密度的測(cè)定

取1 mL藻液10 000 r/min離心1 min，濃縮至合適濃度，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

表2 激素組合的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2L9（34）Orthogonal designation of hormone combination

式中：N為5個(gè)中方格的細(xì)胞總數(shù)，個(gè)；a為稀釋倍數(shù)。

1.4.2 生物量干重的測(cè)定

采用0.22 μm纖維濾膜，105℃烘干稱重，記錄初始質(zhì)量m1。吸取V體積藻液抽濾，105℃烘干再次稱重，記錄質(zhì)量m2。

式中：m1為烘干后濾膜質(zhì)量，g；m2為經(jīng)抽濾并烘干后濾膜質(zhì)量，g；V為抽濾體積，L。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析

采用origin進(jìn)行圖的繪制。使用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)助手專業(yè)版軟件進(jìn)行極差及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)的影響

2.1.1 雨生紅球藻的生長(zhǎng)曲線

雨生紅球藻生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 雨生紅球藻的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of H.plivialis

由圖1可知，接種后隨培養(yǎng)時(shí)間的增加細(xì)胞密度逐漸增大。0 ～1 d細(xì)胞密度增長(zhǎng)緩慢，1 d ～2 d生長(zhǎng)較快，2 d ～4 d生長(zhǎng)速率最大。第6天生長(zhǎng)速度趨于平緩，第8天細(xì)胞密度達(dá)到最大值，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板的測(cè)定細(xì)胞密度達(dá)到4.17×104個(gè)/mL。超過(guò)第8天，細(xì)胞密度開(kāi)始逐漸減小。

2.1.2 乙酸鈉濃度對(duì)細(xì)胞密度的影響

培養(yǎng)基中不同濃度乙酸鈉對(duì)細(xì)胞密度的影響如圖2所示。

圖2 乙酸鈉濃度對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞密度的影響Fig.2 Effect of sodium acetate on cell density of H.plivialis

由圖2可知，添加乙酸鈉對(duì)雨生紅球藻的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。在0 ～15 mmol/L范圍內(nèi)，乙酸鈉的濃度為5 mmol/L時(shí)細(xì)胞密度相對(duì)較大，達(dá)到1.675×105個(gè)/mL，比不添加乙酸鈉的細(xì)胞密度提高了一倍。在顯微鏡下觀察，乙酸鈉的濃度達(dá)到20 mmol/L以后雖然雨生紅球藻生物量干重更高，但此條件下細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)變黃甚至變紅。

雨生紅球藻在快速增殖過(guò)程中需要消耗大量的碳源，但在自養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中泵入無(wú)菌空氣含有的CO2不能滿足其快速生長(zhǎng)的需要，所以培養(yǎng)過(guò)程需要不斷補(bǔ)充無(wú)機(jī)碳源或添加有機(jī)碳源乙酸鈉[13]。大量研究表明在適宜異養(yǎng)或兼養(yǎng)條件下，雨生紅球藻繁殖速度和穩(wěn)定期細(xì)胞密度相較于光自養(yǎng)都有所提高，但不同藻種的最適乙酸鈉濃度有所不同[14-16]。本研究表明，乙酸鈉濃度在0 ～15 mmol/L范圍內(nèi)，藻細(xì)胞一直保持綠色游動(dòng)狀態(tài)，在5 mmol/L濃度下出現(xiàn)峰值；在添加較高濃度乙酸鈉（大于20 mmol/L）下，雨生紅球藻的細(xì)胞密度有較大提高，但是游動(dòng)細(xì)胞的數(shù)量大幅降低，細(xì)胞顏色逐漸變紅，開(kāi)始合成類胡蘿卜素物質(zhì)，不利于細(xì)胞密度的進(jìn)一步提升。所以在發(fā)酵初始階段添加濃度低于15 mmol/L的乙酸鈉可以快速提高細(xì)胞密度。

2.1.3 藻液初始pH值的影響

初始pH值對(duì)細(xì)胞密度變化的影響如圖3所示?？芍?，初始pH值在7.5時(shí)藻液細(xì)胞穩(wěn)定期濃度最大，接種后前2 d雨生紅球藻增長(zhǎng)情況不明顯，2 d之后不同培養(yǎng)基初始pH值下雨生紅球藻的生長(zhǎng)速度差別較大，從高到低 pH 值依次為 7.5、8.0、8.5、7.0。

圖3 初始pH值對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of initial pH on growth of H.plivialis

圖4 不同初始pH值培養(yǎng)基中pH值的變化情況Fig.4 pH curve of the culture with different initial pH

在培養(yǎng)基的初始pH值不同的情況下，對(duì)其pH值的變化進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。圖4可觀察到培養(yǎng)基初始pH值為7.0 ～8.5，接種后pH值均快速上升，第2天藻液的pH值穩(wěn)定在9左右，并逐漸趨近于9.3。研究發(fā)現(xiàn)，pH值低于9時(shí)雨生紅球藻生長(zhǎng)速率慢，pH值在9附近時(shí)生長(zhǎng)速率加快，pH值高于9生長(zhǎng)速率開(kāi)始快速下降甚至停止。

有研究發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻的生長(zhǎng)pH值范圍較為寬廣，但在高pH值下生長(zhǎng)緩慢[17]。由圖4試驗(yàn)結(jié)果可知，藻液的最終pH值穩(wěn)定在9.3，說(shuō)明該藻株可生長(zhǎng)pH值上限可能為9.3，pH值高于9.3不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。從細(xì)胞密度變化可以看出，接種量一定時(shí)，培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)藻種的生長(zhǎng)有一定的影響。初始pH值過(guò)低，在接種的過(guò)程中會(huì)使一部分藻種死亡，初始pH值過(guò)高，在接種時(shí)有利于藻種的生長(zhǎng)，但隨著培養(yǎng)pH值快速增加，不利于藻種的繁殖。

2.1.4 接種量對(duì)藻株生長(zhǎng)趨勢(shì)的影響

在微生物發(fā)酵過(guò)程中，接種量是一個(gè)重要的研究條件。雨生紅球藻的發(fā)酵也是如此，適宜的接種量不僅關(guān)系到藻細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，更關(guān)系到細(xì)胞的生長(zhǎng)速度與穩(wěn)定期細(xì)胞密度[14]。接種量對(duì)生物量的影響如圖5所示。

圖5 接種量對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of inoculation quantity on growth of H.plivialis

從圖5比較不同接種量的雨生紅球藻增長(zhǎng)趨勢(shì)可知，接種量大時(shí)，雨生紅球藻進(jìn)入生長(zhǎng)期時(shí)間縮短，同時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間也縮短，穩(wěn)定期生物量干重也略有提高，接種量不小于20%雨生紅球藻穩(wěn)定期生物量干重相差不大，但接種量低于20%生物量干重較低，僅達(dá)到0.11 g/L。在接種量較低時(shí)，雨生紅球藻進(jìn)入生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期時(shí)間都會(huì)出現(xiàn)延遲，但都會(huì)在培養(yǎng)到第5天進(jìn)入穩(wěn)定期。從研究結(jié)果可以看到雨生紅球藻接種后第1天生物量干重并沒(méi)有增長(zhǎng)，從第2天細(xì)胞都開(kāi)始增殖，不同的接種量差別較大，接種量越大增長(zhǎng)越快，最終穩(wěn)定在0.2 g/L左右。接種量為15%時(shí)增長(zhǎng)緩慢，穩(wěn)定期生物量干重低，只有0.1 g/L。

2.2 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)探究了雨生紅球藻的適宜生長(zhǎng)條件，考慮多種因素之間的相互影響，進(jìn)行了四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)一步優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果如表3、表4所示。

表3 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析Table 3 Results and range analysis of orthogonal experiment on fermentation conditions

表4 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment on fermentation conditions

表3中的極差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)細(xì)胞密度的影響依次是培養(yǎng)時(shí)間、乙酸鈉、接種量、初始pH值。雨生紅球藻的最佳工藝條件為A3B2C1D3，最優(yōu)組合恰好為表3中第8組試驗(yàn)，即培養(yǎng)時(shí)間11 d，乙酸鈉濃度10 mmol/L，初始pH值為7.5，接種量30%，得到的最佳優(yōu)化條件下雨生紅球藻的細(xì)胞密度可達(dá)到7.3×105個(gè)/mL。

2.3 植物激素的正交試驗(yàn)結(jié)果

不同植物激素組合條件對(duì)藻液細(xì)胞密度的影響，試驗(yàn)結(jié)果如表5、表6所示。

表5 激素組合的正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析Table 5 Results and range analysis of orthogonal experiment on hormone combination

表6 激素組合正交試驗(yàn)的方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment on hormone combination

由表5可得，植物激素對(duì)雨生紅球藻的高密度培養(yǎng)具有一定的促進(jìn)作用，添加激素的細(xì)胞密度均高于未添加激素藻液的最高細(xì)胞密度。各因素對(duì)藻液細(xì)胞密度的影響依次是 2，4-D、NAA、6-BA、3-IBA，得到激素的組合最佳工藝條件為A2B2C2D2，即3-IBA、2，4-D、NAA、6-BA 添加量分別為 0.5、0.1、0.01、0.1 mg/L；經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在該條件下細(xì)胞密度為1.17×106個(gè)/mL。

報(bào)道指出激素對(duì)藻類的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，黃偉卿、岳陳陳等[18-20]研究了不同激素單獨(dú)和組合應(yīng)用對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響，并且取得了有效的成果，由此可見(jiàn)添加植物激素對(duì)微藻生長(zhǎng)具有一定的影響作用。在本研究中，選用了4種植物激素進(jìn)行研究，通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果得出這些激素在適宜濃度下對(duì)雨生紅球藻的生長(zhǎng)都具有促進(jìn)作用，其中2，4-D和NAA對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大。添加激素優(yōu)化后，最終雨生紅球藻的細(xì)胞密度可達(dá)1.17×106個(gè)/mL，比優(yōu)化之前提高28倍。

3 結(jié)論

本研究得到適合雨生紅球藻NIES-144發(fā)酵培養(yǎng)的最佳工藝：發(fā)酵培養(yǎng)周期為11 d，碳源乙酸鈉添加量為10 mmol/L，初始pH值為7.5，接種量控制在30%，添加植物激素可以提高細(xì)胞密度，激素3-IBA、2，4-D、NAA 和 6-BA 的添加量分別為 0.5、0.1、0.01、0.1 mg/L，優(yōu)化后發(fā)酵雨生紅球藻的細(xì)胞密度可達(dá)1.17×106個(gè)/mL，比優(yōu)化之前提高28倍。本研究為雨生紅球藻發(fā)酵培養(yǎng)提供必要的依據(jù)，如何規(guī)?；瘧?yīng)用還需進(jìn)一步優(yōu)化。