楊文娟，侯旭杰，，阿依古麗·吾斯曼，侯文鑫，郭芹，蒲云峰，*，王強*

（1.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3.中國農業(yè)科學院 農產品加工研究所，北京 100193）

多酚一般指多酚類化合物，包括復合多酚、黃酮類化合物、花青素等[1]。多酚多存在于谷物[2]、堅果類[3-4]、水果，如葡萄、茶葉、綠豆[5-7]中，并且含量豐富。研究表明，多酚在藥理方面具有很強的抗氧化性、降低血脂、增強免疫力、抗腫瘤等功能活性[8-15]，有促進人體健康的作用。因多酚極強的抗氧化活性被稱為“第七類營養(yǎng)素”[16]。目前常見的多酚提取工藝有溶劑提取法、微波輔助提取法、分光光度法和高效液相色譜法等[17]。

花生是我國的主要油料作物之一?；ㄉ碑a物中存在大量的多酚類物質，目前，許多研究者從花生的殼和紅衣中提取多酚[18-19]，以及從花生的根、莖、葉、紅衣、殼中提取白藜蘆醇、原花青素、木犀草素等[20-24]。花生中的多酚類物質除了白藜蘆醇、原花青素等還存在許多其它的酚類物質，如茶多酚、p-香豆酸等，都具有相同的抑菌、防輻射等效果。但在花生根的多酚類物質提取方面研究較少，目前常見的是在花生根中提取白藜蘆醇[22]，因此本研究以花生根為原料，探究花生根中的多酚含量，以及檢測花生根中多酚類物質的主要成分。本研究給花生副產物中多酚的提取提供了更多理論依據(jù)。提取花生根中的多酚類物質不僅提高了花生根的綜合利用價值和經濟價值，也使花生的各個部位都更加有效地利用起來，而且為進行針對性的藥物和保健食品的開發(fā)應用提供原材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生根：塔里木大學種植的花生試驗田；甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；沒食子酸標準品（純度≥98%）、茶多酚標準品（純度≥98%）、白藜蘆醇標準品（純度≥98%）、p-香豆酸標準品（純度≥98%）、咖啡酸標準品（純度≥98%）：上海源葉生物科技公司；福林酚試劑（2 mol/L）：美國米瑞達科技有限公司；無水乙醇：天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；無水碳酸鈉（≥99.8%）：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計（UV-2450）、高效液相色譜儀（LC-20A）：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；高速冷凍離心機（TGL-20br）：上海安亭科學儀器廠；電熱鼓風干燥箱（GZX9240MBE）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；超聲波清洗機（SB-5200DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；無篩粉碎機（SZNL-150）：廣州市旭朗機械設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的預處理

將從試驗田收獲的花生根洗凈、烘干、用高速萬能粉碎機粉碎后過60目篩。裝瓶放置干燥處留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 花生根中多酚提取的工藝流程

稱取花生根粉末 1.0 g，按料液比 1∶30（g/mL）加入體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，置于超聲波清洗器中，超聲頻率40 kHz、功率為200 W、在一定溫度下超聲處理一段時間后，經離心機4 000 r/min離心10 min。取上清液用無水乙醇稀釋5倍，即得多酚提取液。

1.3.3 花生根中多酚含量的測定

1.3.3.1 沒食子酸標準曲線的繪制

精確稱取沒食子酸標準品10 mg，用水溶解并定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的標準液。取15 mL具塞試管，先加入一定量水（標準品和80%水的總體積為10.2mL）分別準確移取該溶液 0.2 、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，再分別加入0.3 mL福林酚試劑，反應5 min后加入1mL 15% Na2CO3溶液，加蓋搖勻，避光條件下反應2 h，以無水乙醇為空白對照，在745 nm處測定吸光度，得到回歸方程y=0.956 1x+0.123 5，R2=0.999 1，沒食子酸標準曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

1.3.3.2 多酚的測定

具塞試管中加入10 mL超純水，再加入0.2 mL樣液和0.3 mL福林酚試劑反應5 min后，加入1 mL 15% Na2CO3溶液，搖勻于室溫24℃下避光反應2 h，在745 nm處測定吸光度值，算出多酚提取量，單位為mg/g。

1.4 單因素試驗

分別考察乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比[1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）]、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、提取溫度（30、35、40、45、50℃）4個因素對花生根中多酚提取量的影響。每組試驗重復3次。

1.5 正交試驗

在單因素基礎上，分別考察A乙醇體積分數(shù)、B料液比、C提取溫度、D超聲時間因素，得到最佳工藝。設計L9（34）正交試驗表。

1.6 花生根中多酚成分分析

1.6.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAXSB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：280 nm；流動相：A為甲醇，B為0.5%甲酸；總時長：60 min；流速：0.7 mL/min。

1.6.2 洗脫條件（320 nm和280 nm）

流動相：流動相A為甲醇，流動相B為0.5%甲酸。洗脫程序：0～6 min，B 為 90%；6 min ～10 min，B為 90%～80%；10 min～11 min，B 為 80%；11 min～15 min，B 為 75%～70%；15 min～25 min，B 為 70%～60%；25 min～32 min，B 為60%～45%；32 min～40 min，B 為 45%～0%；40 min～50 min，B 為 0%；50 min～51 min，B 為 0%～90%；51 min～60 min，B為90%。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對花生根中多酚提取量影響

稱取1.0 g花生根粉末，按料液比1∶20（g/mL）的比例加入乙醇后，置于超聲波清洗器中，30℃下超聲輔助提取30min，在乙醇體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%條件下分別進行多酚提取，提取量如圖2所示。

圖2 乙醇體積分數(shù)對多酚提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on polyphenol extraction

如圖2所示，當乙醇體積分數(shù)為50% ～70%時，花生根中多酚提取量與乙醇體積分數(shù)為正相關，在70%時，提取量達到最大值。乙醇體積分數(shù)達到70%后多酚提取量呈逐漸遞減趨勢。乙醇體積分數(shù)可能會影響多酚的溶解度[25]。乙醇的體積分數(shù)增加，花生根中脂溶性物質和醇溶性物質溶出量增加，使多酚與乙醇-水分子結合量降低，從而使多酚的提取量降低。

2.1.2 料液比對多酚提取量的影響

稱取1.0 g花生根粉末，取體積分數(shù)為70%的乙醇，按照料液比分別為 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）分別置于超聲波清洗器中，30℃下超聲輔助提取30 min。所得多酚的提取量如圖3所示。

由圖3可知，多酚的提取量隨著溶劑體積的增加而逐漸增加，當料液比為1∶40（g/mL）時多酚的提取量達到最大值。這是由于乙醇的質量越大，多酚的溶出率則越高。出于經濟效益，選取料液比為1∶30（g/mL）時為最佳。

2.1.3 提取溫度對多酚提取量的影響

圖3 料液比對多酚提取量的影響Fig.3 Effect of the liquid ratio on polyphenol extraction

稱取1.0 g花生根粉末，按料液比1∶20（g/mL）的比例加入乙醇后，置于超聲波清洗器中，超聲輔助提取 30 min，分別在提取溫度為 30、35、40、45、50 ℃的條件下，進行多酚的提取，多酚的提取量如圖4所示。

圖4 提取溫度對多酚提取量的影響Fig.4 Effect of the extraction temperature on polyphenol extraction

由圖4可知，溫度在30℃～40℃之間，多酚的提取量與溫度呈正相關，40℃以后多酚的提取量逐漸下降。這一現(xiàn)象是由于溫度升高分子運動加快，溶解速率增加，導致花生根中多酚的溶解量增大。隨著溫度的升高，溶劑揮發(fā)導致溶解度降低提取量下降。因此，提取多酚的最佳適應提取溫度為40℃。

2.1.4 超聲時間對多酚提取量的影響

稱取1.0 g花生根粉末，按料液比1∶20（g/mL）的比例加入乙醇后，置于超聲波清洗器中，提取溫度30℃，考察超聲時間分別在 10、20、30、40、50 min 的條件下對多酚提取量的影響，多酚的提取量如圖5所示。

圖5 超聲時間對多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on polyphenol extraction

如圖5所示，在時間為10 min ～40 min時，提取量與超聲時間呈正相關。提取量隨著超聲提取時間逐漸增加，當超聲時間超過40 min后，超聲波可能會對多酚物質造成損失，從而提取量下降。因此40 min時多酚的提取量最佳。

2.2 正交試驗結果分析

花生根中多酚的提取正交表見表1。

表1 正交試驗表Table 1 Orthogonal table

由表1可知，各因素對提取量的影響大小順序為：A＞C＞B＞D，即當乙醇體積分數(shù)為70%、料液比為1∶30（g/mL）時，在超聲波清洗器中45℃條件下提取50 min得到最優(yōu)組合為A2B2C3D3。由于在正交試驗過程中的最佳組合與正交試驗所得的最佳組合不同，故需驗證試驗。

按照正交表中最佳組合A2B2C3D1和正交試驗各因素最佳水平組A2B2C3D3進行驗證試驗，得到花生根中多酚的平均得量分別為1.497 mg/g和1.629 mg/g，相對標準偏差分別為2.6%和1.9%，均小于5%，表明精密度較好，因此試驗最佳組合為A2B2C3D3，即乙醇體積分數(shù)為70%、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度45℃、超聲時間50 min，且最佳提取量為1.629 mg/g。

2.3 花生根多酚提取物的高效液相（high performance liquid chromatography，HPLC）分析結果

超聲波輔助提取法測得的最佳組合為供試樣液，即乙醇體積分數(shù)為70%、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度45℃、超聲時間50min時所提取的樣液，用0.22μm微孔濾膜過濾，所得樣液即為待測液，放入進行自動進樣，并記錄色譜圖?；ㄉ喾犹崛∥锏囊合啵℉PLC）分析見表2。高效液相色譜法對花生根提取物的成分分析見圖6。

表2 花生根多酚提取物的高效液相分析Table 2 High performance liquid chromatography（HPLC）analysis of peanut root polyphenol extract

圖6 花生根多酚提取物分析色譜圖Fig.6 Peanut root polyphenol extract analysis chromatography

從表2、圖6中可以看出，花生根中多酚提取物在波長為278 nm下檢測到了兒茶素（1號峰），在波長為310 nm～317 nm之間檢測出了白藜蘆醇（4號峰）、p-香豆酸（3號峰）、咖啡酸（2號峰），在花生根中檢測出的多酚類物質中p-香豆酸和咖啡酸含量相對較少。提取物中還有許多多酚類物質（5號峰），他們的最大吸收波長都在310 nm～317 nm之間。

3 結論

使用超聲輔助提取法來提取花生根中的多酚，得到的優(yōu)化工藝為乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度 45℃、超聲時間 50 min，此條件下得到的花生根中多酚含量為1.629 mg/g。用高效液相色譜法測定花生根提取物可以得出兒茶素、白藜蘆醇、咖啡酸、p-香豆酸4種單體酚，提取物中還有許多多酚類物質，其最大吸收波長都在310 nm～317 nm之間。通過提取花生根中的多酚不僅提高了花生副產物的綜合利用量，為化妝品、藥品行業(yè)提供原材料，而且使花生的各個部位更加有效的利用起來，物盡其用。