王豐琳, 楊三東, 周新穎, 封 嬌, 唐 濤*, 李 彤

(1. 大連依利特分析儀器有限公司,遼寧 大連 116023;2. 中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所,江蘇 蘇州 215163)

氨磺必利是一種苯酰胺類第2代抗精神病藥物,可選擇性地與多巴胺D2、D3受體結(jié)合,通過阻斷多巴胺D2、D3受體,改善精神分裂癥陰性及陽性癥狀[1]。德國神經(jīng)精神藥理學(xué)與藥物精神病學(xué)協(xié)會[2](Arbeitsgemeinschaft für Neuropsychopharmakologie und Pharmakopsychiatrie,AGNP)在2017年更新的《神經(jīng)精神藥理學(xué)治療藥物檢測共識指南》(以下簡稱《指南》)中推薦的血液中有效治療濃度范圍是100～320 ng/mL,并將其治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring,TDM)推薦等級列為一級。由于血液基質(zhì)比較復(fù)雜且藥物濃度較低,為了減小其他物質(zhì)對血液中藥物濃度檢測的干擾,提高檢測靈敏度,多采用不同的前處理技術(shù)結(jié)合色譜法及高靈敏度檢測器進(jìn)行分析檢測[3,4]。陳穎等[5,6]分別以乙醚和乙酸乙酯萃取血漿與血清中的氨磺必利等治療藥物,由于萃取溶劑用量較大,需要采取氮吹、復(fù)溶等額外操作控制進(jìn)樣量及檢測靈敏度,血清基質(zhì)下的定量限達(dá)到了25 ng/mL。Kudris等[7]發(fā)展了一種離線固相萃取結(jié)合液相色譜-熒光檢測器分析血漿中氨磺必利的方法,利用固相萃取柱對血漿樣品進(jìn)行離線凈化富集,凈化富集后的樣品經(jīng)過蒸干、復(fù)溶后進(jìn)樣分析,以高靈敏度的熒光檢測器進(jìn)行檢測,定量限可達(dá)10 ng/mL。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由于具有較高分辨率和靈敏度,也常用于治療藥物的監(jiān)測[8,9]。Mokhtar等[10]利用超高效液相色譜-離子肼質(zhì)譜同時檢測血液中113種藥物的濃度,其中氨磺必利的檢出限為3 ng/mL,但樣品處理過程同樣需要液液萃取、氮吹、復(fù)溶等操作。這些具有復(fù)雜前處理過程的分析方法盡管能夠滿足《指南》要求的檢測濃度范圍,但前處理過程繁瑣耗時,分析效率低,且處理過程中容易產(chǎn)生樣品的損失,不利于方法的推廣。此外,質(zhì)譜檢測雖然具有極高的檢測靈敏度,但較高的儀器價格卻會限制其應(yīng)用擴(kuò)展,同時,質(zhì)譜定量常用的同位素內(nèi)標(biāo)試劑也增加了日常檢測的成本[11]。

多柱二維液相色譜是分離分析復(fù)雜樣品的重要工具[12],在蛋白質(zhì)組學(xué)[13]、代謝組學(xué)[14]、中草藥[15]分析等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用,同樣也適用于在復(fù)雜的血液基質(zhì)中分析藥物組分[16]。由于二維液相色譜是多種分離模式的組合,因此比常規(guī)一維色譜具有更好的分離能力,能夠?qū)崿F(xiàn)待測物與干擾組分的快速分離。此外,二維液相色譜也可以基于切換閥結(jié)構(gòu)實現(xiàn)大體積樣品的在線富集、中心切割樣品轉(zhuǎn)移以及自動化分析,可減少人為因素的干擾,具有更高的靈敏度和分析效率[17]。尚翔等[18]利用二維液相色譜建立氨磺必利血藥濃度檢測方法,并對患者的血藥濃度、服藥劑量、年齡、性別之間的關(guān)系進(jìn)行了分析。

本文采用中心切割的樣品轉(zhuǎn)移接口形式,構(gòu)建了集成化的多柱二維液相色譜系統(tǒng),兼具大體積樣品直接進(jìn)樣、輔助泵稀釋多維樣品轉(zhuǎn)移以及全模塊自動化控制等功能,并基于該系統(tǒng)對血清中氨磺必利的檢測進(jìn)行了方法學(xué)研究。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

3臺P1100高壓恒流泵,D1100紫外-可見檢測器,S3100自動進(jìn)樣器,W5100色譜工作站,色譜柱均為大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品。兩位六通切換閥(C82X-6676,VICI)。高速離心機(jī)(3K15,Sigma)。紫外分光光度計(UV2900,上海舜宇恒平)。

乙腈(色譜純,Sigma),純化水(Milli-Q),磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀(分析純,科密歐),高氯酸(分析純,70%,科密歐),氨磺必利對照品(>98%,阿拉丁)。血清樣品使用前儲存在-20 ℃冰箱中。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及樣品前處理

標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 mg/mL):稱取10.0 mg氨磺必利對照品于10 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量,用6%(v/v)高氯酸逐級稀釋成質(zhì)量濃度為10、25、50、100、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

血清樣品前處理:將血清樣品從冰箱中取出,自然解凍。取血清樣品1 mL,加入3倍體積的高氯酸(6%,v/v)/甲醇(85/15,v/v)[19],渦旋2 min,10 000 r/min高速離心5 min,取上清液進(jìn)樣分析。

1.3 色譜條件

第一維分析柱,Supersil ODS2(150 mm×4.6 mm,5 μm);第二維分析柱,SinoChrom ODS-BP(150 mm×4.6 mm,5 μm);捕集柱,Supersil SCX(10 mm×4.6 mm,5 μm)。進(jìn)樣量:300 μL;檢測波長:280 nm。

流動相A,乙腈/磷酸緩沖液(25 mmol/L,pH 3.0)(20/80,v/v),1.0 mL/min。流動相B,磷酸緩沖液(25 mmol/L,pH 3.0),流速梯度:0～4 min,0.1 mL/min; 4～5 min,1.0 mL/min; 5～12 min,0.1 mL/min。流動相C,乙腈/磷酸緩沖液(25 mmol/L,pH 7.0)(25/75,v/v),1.0 mL/min。

切換閥0～4 min,實線位;4～5 min,虛線位;5～12 min,實線位(見圖1)。

圖 1 多柱二維液相色譜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the multi-column two- dimensional liquid chromatographic system

2 結(jié)果與討論

2.1 集成化多柱二維液相色譜系統(tǒng)的構(gòu)建

系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。輸液泵A、B、C分別輸送流動相A、B、C。初始條件下,切換閥處于實線位,優(yōu)先從第一維色譜柱上洗脫下的非待測組分通過切換閥排入廢液流路。當(dāng)待測組分被洗脫下時,切換閥切換至虛線位,使第一維色譜柱出口與捕集柱相通。同時,通過三通與第一維色譜柱出口相連的輸液泵B流量提高,稀釋第一維洗脫下的溶劑強(qiáng)度。這種接口結(jié)構(gòu)能夠使待測組分更多地保留在捕集柱上,提高樣品轉(zhuǎn)移與捕集的效率,避免有機(jī)相比例過高引起樣品的展寬和損失。捕集結(jié)束后,切換閥切換回實線位,由輸液泵C將捕集柱上的待測組分洗脫至第二維色譜柱上進(jìn)行進(jìn)一步分離。由于實驗所用的色譜工作站能夠同時控制系統(tǒng)中的所有模塊,并且可以序列運(yùn)行,因此該集成化多柱二維液相色譜系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)自動化分析。

2.2 氨磺必利紫外吸收光譜測試

利用紫外可見分光光度計對氨磺必利進(jìn)行光譜圖掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在紫外區(qū)有2個特征吸收波長,分別為226 nm和280 nm。其中226 nm響應(yīng)值相對較高,但考慮到此區(qū)域干擾較大,因此選擇次大吸收峰位置280 nm作為檢測波長。

圖 2 不同進(jìn)樣體積的1 μg/mL氨磺必利標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of 1 μg/mL amisulpride solution at different injection volumes Chromatographic conditions: mobile phase,ACN/phosphate buffer (25 mmol/L,pH 3.0) (20/80,v/v).

2.3 氨磺必利標(biāo)準(zhǔn)品的一維分析結(jié)果

以1 μg/mL氨磺必利標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣,考察不同進(jìn)樣體積對保留時間峰面積的影響,疊加譜圖見圖2。隨著進(jìn)樣體積的增大,標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時間逐漸增加,但峰面積與進(jìn)樣量的線性關(guān)系依然良好(r=0.997)。保留時間的延長可能與樣品溶劑的影響有關(guān),隨著進(jìn)樣體積的增大,樣品溶劑(6%(v/v)高氯酸)會逐漸降低流動相的洗脫強(qiáng)度,使樣品保留加強(qiáng)。但由于進(jìn)樣體積的增大并未造成明顯的溶劑效應(yīng),使峰形變差,因此可以通過增加進(jìn)樣量的方式提高檢測靈敏度。

圖 3 100 ng/mL氨磺必利標(biāo)準(zhǔn)溶液在(a)接捕集柱與 (b)不接捕集柱時的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of 100 ng/mLamisulpride solution (a) with and (b) without trap column and pump B Chromatographic conditions: mobile phase,ACN/phosphate buffer (25 mmol/L,pH 3.0)(20/80,v/v),1 mL/min; pump B mobile phase,phosphate buffer (25 mmol/L,pH 3.0),1 mL/min; injection volume,300 μL.

以接近檢出限要求[2]的100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液為分析對象,進(jìn)一步考察直接進(jìn)樣及增加捕集柱和輸液泵B后出峰時間的差異性,以便準(zhǔn)確設(shè)定捕集柱切入系統(tǒng)時間,結(jié)果見圖3。單獨(dú)進(jìn)樣時,標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為4.53 min,半峰寬為0.11 min(峰起落點(diǎn)4.32～4.82 min)。增加捕集柱及開啟輸液泵B后,保留時間為5.84 min,半峰寬0.31 min(峰起落點(diǎn)5.44～6.18 min)。因此,基于上述數(shù)據(jù),設(shè)定切入捕集柱時間范圍為4.00～5.00 min,可以有效保證目標(biāo)樣品均能完成捕集,并且不會從捕集柱上二次洗脫下來。

2.4 多柱二維系統(tǒng)分析氨磺必利

2.4.1二維分析方法

按照1.3節(jié)所述方法,系統(tǒng)的第一維需要對樣品進(jìn)行快速拆分,因而使用疏水性較弱的Supersil ODS2反相色譜柱。以pH 3.0的磷酸緩沖液和乙腈混合作為第一維流動相,可使氨磺必利帶正電,進(jìn)一步降低其在第一維反相柱上的保留,同時實現(xiàn)了對加標(biāo)血清樣品的初步分離。通過中心切割的方式,可將帶正電的氨磺必利與極性相近的組分轉(zhuǎn)移至SCX捕集柱上。為了降低第一維洗脫液中乙腈對樣品捕集的影響,以pH 3.0的流動相B對洗脫溶液進(jìn)行稀釋,同時維持體系的pH,確保帶正電的氨磺必利能夠在SCX捕集柱上保留。捕集結(jié)束后,樣品被轉(zhuǎn)移至第二維進(jìn)行進(jìn)一步分離。第二維所用的色譜柱填料為SinoChrom ODS-BP,疏水性較強(qiáng),并且在C18鍵合填料的基礎(chǔ)上使用了堿性封尾技術(shù),降低硅羥基殘留,更加適合堿性物質(zhì)的分離,改善峰形。為了加快分析速度,SCX捕集柱使用了10 mm的短柱;同時,第二維流動相使用pH 7.0的磷酸緩沖液和乙腈的混合液,不僅可降低氨磺必利的解離程度,使其能夠在SCX捕集柱上被快速地洗脫下來,還能夠改善氨磺必利在第二維反相柱上的保留行為,實現(xiàn)其與雜質(zhì)的基線分離。

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)液的二維分析結(jié)果

按照1.3節(jié)二維系統(tǒng)流程和色譜條件,對10、25、50、100、200 ng/mL的氨磺必利標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行了分析,以峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x,ng/mL)進(jìn)行線性回歸,得線性方程為y=1.54x-0.91,r為0.999 8,相關(guān)性良好。

2.4.3加標(biāo)血樣的分析結(jié)果

加標(biāo)血清樣品的疊加譜圖如圖4所示。在50 ng/mL和100 ng/mL兩個加標(biāo)水平下,3個平行試驗的回收率在73.7%～76.8%之間,回收率雖然不是特別高,但結(jié)果穩(wěn)定(RSD不大于1.6%)。樣品采集基線噪聲實測為0.05 mAU,根據(jù)50 ng/mL加標(biāo)測試平均峰高(1.03 mAU)測算,方法檢出限(S/N=3)為7.28 ng/mL,定量限(S/N=10)為24.27 ng/mL。

圖 4 不同水平加標(biāo)血樣分析的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of different spiked serum samples a. 100 ng/mL spiked sample; b. 50 ng/mL spiked sample.

3 結(jié)論

本文以中心切割模式構(gòu)建了集成化多柱二維液相色譜系統(tǒng),同時在樣品接口處增加旁路,以輔助泵調(diào)節(jié)第一維洗脫下的樣品溶劑強(qiáng)度,使樣品能夠有效地捕集在捕集柱上。以二維模式分析血清中的氨磺必利,12 min內(nèi)可以完成樣品分析。氨磺必利在10～200 ng/mL范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好,加標(biāo)回收率穩(wěn)定,定量限為24.27 ng/mL,滿足100～320 ng/mL的AGNP推薦藥物監(jiān)控范圍要求(低于監(jiān)控范圍的下限)。所構(gòu)建的血藥濃度多柱二維分析系統(tǒng)能夠在較短的時間內(nèi)在線去除血清中大部分的基質(zhì)干擾,減少了血清樣品的前處理流程,確保待測組分的分離度。同時儀器價格、使用及維護(hù)成本均遠(yuǎn)低于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng),適合在臨床血藥濃度監(jiān)測領(lǐng)域推廣使用。