王藝曉, 李金花*, 王莉燕, 齊 驥, 陳令新

(1. 中國科學院煙臺海岸帶研究所,中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室,山東省海岸帶環(huán)境過程重點實驗室,海岸帶環(huán)境工程技術研究與發(fā)展中心,山東 煙臺 264003; 2. 中國科學院大學資源與環(huán)境學院,北京 100049)

分子印跡聚合物(MIPs)是通過模擬酶與底物或抗原抗體特異性結合原理制備的高分子聚合物,因其識別特異性、結構預定性、易制備、耐受性強等優(yōu)點而被廣泛應用[1]。目前已發(fā)展多種印跡策略用于MIPs制備,提高了選擇吸附性能,擴展了應用。其中,片段分子印跡聚合物(FMIPs)策略是通過選取目標物的一段特異性識別序列作為模板用于合成MIPs,克服了某些目標物不易獲得或體積較大不適合作為模板的問題,尤其對于易失活的生物大分子及微生物的印跡意義重大;虛擬模板分子印跡聚合物(DMIPs)策略是選用與目標物的特異性結構相似或相同的其他物質,替代目標物作為模板制備MIPs,可在很大程度上解決模板不易獲得或較昂貴等問題,以及避免識別吸附過程中模板可能泄漏,降低對分析造成的影響。本文主要綜述了片段模板MIPs在生物醫(yī)藥領域、虛擬模板MIPs在樣品前處理和傳感分析領域的最新研究動態(tài)和典型應用。

1 片段印跡策略

片段印跡策略是在MIPs制備過程中,用目標化合物的一部分代替整個目標化合物作為模板。某些目標化合物尤其是生物大分子或細菌、病毒等微生物,具有不易獲得、性質不穩(wěn)定或毒性強等特點,因此無法用完整的靶分子作為模板制備MIPs。使用靶分子中的一段特異性片段代替靶分子作為模板制備出FMIPs的片段印跡策略可很大程度上解決上述問題,并可簡化制備步驟,提高聚合物性能。片段印跡多應用于生物醫(yī)藥領域,尤其是蛋白質和微生物檢測方面,對哺乳動物細胞印跡的研究也有進展,此外,FMIPs在食品分析領域也有應用。

1.1 生物醫(yī)藥

片段印跡策略為整體印跡有困難、易失活或不易保存的目標物的印跡提供了可行的方法。近年來,片段印跡策略的研究工作集中在與大分子密切相關的生物醫(yī)藥領域,主要包括蛋白質印跡、微生物印跡和哺乳動物細胞印跡。

1.1.1蛋白質印跡

蛋白質相對分子質量大，結構復雜，對外界條件變化敏感，較易失活，不易溶于有機溶劑，不易與MIPs識別結合,這些都增加了制備蛋白質MIPs的難度。片段印跡策略的使用,很大程度降低了蛋白質MIPs制備過程的難度,提高了MIPs對大分子印跡的能力。在蛋白質MIPs制備過程中,片段印跡策略通常是指將蛋白質的一段特異性氨基酸序列作為整個蛋白質識別的模板,這些特異性部分又稱作抗原決定簇或表位,因此也稱作表位印跡策略[2]。

圖 1 FMIPs的合成路線及裝載DOX的FMIPs在腫瘤治療上的應用[2]Fig. 1 Synthesis route of FMIPs and the application of DOX-loaded FMIPs on tumor treatment[2] FMIPs: fragment molecularly imprinted polymers; DOX: doxorubicin; TFE: trifluoroethanol; NPs: nanoparticles; MPS: 3-mercapto-1-propanesulfonic acid sodium salt; EPR: enhanced permeability and retention effect.

研究人員[2,3]開展了系列表位印跡策略制備蛋白質MIPs的研究。例如,以P32膜蛋白(4T1癌細胞表面過表達的膜蛋白)N端表位為主要模板、阿霉素(DOX)為次要模板,采用沉淀聚合反應制備了FMIPs納米顆粒[2]。該FMIPs的DOX印跡腔可穩(wěn)定攜帶藥物,保持藥物活性,表位印跡腔可使FMIPs特異性識別P32膜蛋白。如圖1所示,該實驗選取一段α-螺旋蛋白作為表位模板,制備的熒光FMIPs可以搭載藥物并可特異性識別表面具有α-螺旋蛋白的癌細胞,即4T1癌細胞,可通過熒光成像對癌細胞進行定位。對荷瘤小鼠的治療中,該FMIPs@DOX的治療效果遠高于普通藥物的治療效果,具有良好的臨床應用價值。隨后,他們又以人血清白蛋白(HSA)的C端肽和轉鐵蛋白(Trf)的C端肽為表位模板制備了一種熱敏感的雙模板表位FMIPs,能夠同時識別HSA和Trf[3]。采用金屬螯合印跡和蒸餾沉淀的方法,以丙烯酸鋅和異丙基丙烯酰胺為功能單體,制備了FMIPs。該方法制備時間短,僅需30 min。FMIPs對樣品中的HSA和Trf均有良好的識別吸附能力,最大吸附量分別為103.67 mg/g和68.48 mg/g,印跡因子分別為2.57和2.17,且具有熱敏性能,能夠實現(xiàn)溫控吸附和釋放靶蛋白。

1.1.2微生物印跡

以細菌為模板制備MIPs通常是將整個細菌作為模板制備全細胞受體檢測聚合物;然而,大部分細菌雖有細胞壁的支撐但仍具有形變特點,無法滿足印跡腔單一的剛性結構要求,在制備及后續(xù)識別吸附上有困難,且如果操作不當容易被感染。片段印跡策略利用細菌的特異性片段(如糖蛋白、聚糖等)作為模板進行印跡,可創(chuàng)造更多的結合位點,降低制備難度,優(yōu)化制備工藝,并且安全可靠。

對微生物片段印跡策略的應用多是針對其特有的蛋白質表位進行的。Gupta等[4]構建了一種檢測腦膜炎患者血樣中奈瑟菌的電化學石英晶體微天平(EQCM)傳感器。以存在于腦膜炎奈瑟菌中的鐵結合蛋白(ftp A)為模板,在EQCM的鍍金表面通過自組裝反應制備了單層膜,利用硫醇鍵將模板蛋白錨定到單層膜上,形成分子印跡膜。該分子印跡膜用于腦膜炎患者實際血樣檢測時,對ftp A蛋白的檢出限為1.39 ng/mL,印跡因子為12.27,表明對模板分子具有優(yōu)異的識別和結合能力。相比于全細胞受體聚合物的識別檢測,該方法為快速檢測腦膜炎提供了一種可靠、簡便、成本低的診斷工具,臨床應用潛力巨大。Kushwaha等[5]發(fā)展了一種EQCM傳感器用于檢測麻風分歧桿菌。利用麻風分歧桿菌表面蛋白的表位序列作為模板,3-甲基丙烯酸磺丙酯鉀鹽、甲基丙烯酸芐酯和4-氨基苯硫酚作為功能單體,合成的FMIPs能夠與感染患者血樣中帶有表位序列的麻風分歧桿菌特異性結合,而不結合其他血漿蛋白。該FMIPs傳感器對實際樣品中麻風分歧桿菌的檢出限和定量限分別低至0.161 nmol/L和0.536 nmol/L,為早期預防及快速診斷麻風病提供了有效手段。

病毒感染性強,對生命健康危害較大。以病毒為模板的MIPs快速檢測方法,在疾病預防和診療方面有很大的應用潛力。但對于病毒MIPs材料的制備存在很多問題,比如病毒在外界環(huán)境下較脆弱、易失活,實驗人員操作不當有感染風險等。通過片段印跡策略,選取病毒表面能夠代表整個病毒的一段特異性序列作為模板,可以很大程度上解決上述問題。Chou等[6]從人類免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶中選取螺旋表位肽作為模板,并將肽模板與水、三氟乙醇和乙腈按一定比例混合,以擴大溶液中的螺旋構象,在石英晶體微天平芯片上制備螺旋表位介導的MIPs。該MIPs對HIV蛋白酶有很高的親和力,所構建的傳感器對HIV蛋白酶的檢出限為0.1 ng/mL,提供了一種臨床檢測病毒的可行方法,這項技術有望結合HIV抑制劑對HIV病毒進行靶向治療,前景廣闊。

1.1.3哺乳動物細胞印跡

相比于細菌細胞的細胞壁支撐作用,哺乳動物細胞的細胞膜較脆弱,因此傳統(tǒng)的整體印跡方法,直接印跡動物細胞需要更溫和的條件,甚至需要對細胞進行一定的前處理。相較于對哺乳動物細胞的整體印跡技術,片段印跡策略是利用哺乳動物細胞膜上有豐富的受體,包括糖蛋白、糖脂等物質。不同的細胞類型表達不同的蛋白質、糖類等,以這些物質為模板制備FMIPs,需要注意的是用于細胞的MIPs要具有較好的生物相容性,另外,片段印跡策略制備的FMIPs大小應與體內大分子相近,以保證其在血管、淋巴系統(tǒng)等組織中的擴散和循環(huán)。

癌細胞表面會表達大量的特異性糖蛋白、糖脂及其他化合物,因此片段印跡策略在癌細胞的靶向定位及成像上有著豐富的應用。除上文提到的以蛋白質表位作為模板制備的FMIPs可以作為遞藥系統(tǒng)對癌細胞定位、治療、成像外,多糖以及酸類物質也是重要的片段印跡策略的模板。Liu等[7]以唾液酸為模板,設計合成了一種苯基硼酸基團修飾改性的熒光FMIPs。使用該聚合物分別對表面過度表達唾液酸的DU145癌細胞,以及表面未過度表達唾液酸的HeLa細胞進行檢測。實驗結果表明,FMIPs對DU145癌細胞表現(xiàn)出選擇性染色,且熒光強度良好,但即使在長時間的孵育后,FMIPs也沒有進入HeLa細胞。這種方法特異性高,其熒光特性可以準確地對癌細胞進行定位。普通的血型鑒別通常是基于抗體與血細胞表面的抗原識別結合產生凝集反應的原理,通過FMIPs特異性識別結合血細胞表面的抗原區(qū)分不同血型的方法,更加簡便快捷,且避免了抗體作為一種蛋白質活性易受外界環(huán)境因素影響的缺點?？乖瓫Q定簇A和B是存在于人類紅細胞膜上的兩種最重要的抗原,且他們均由寡糖分子決定類型。Piletsky等[8]以半乳糖、巖藻糖和半乳糖組成的B型三糖作為模板制備了磁性分子印跡納米顆粒。具有順磁性的FMIPs會將已特異性識別結合的血細胞吸引到磁鐵上,導致樣本褪色,從而進行鑒別。這項研究證明了FMIPs在鑒別血型上的可行性,但同時鑒別4種血型還存在一定困難。

1.2 食品分析

片段印跡策略除在生物醫(yī)藥領域有大量應用外,在食品分析領域也有應用,但在其他領域的最新應用鮮有報道。如以D-葡萄糖為片段模板選擇性提取大豆中的三種黃酮苷[9],以沒食子酸為片段模板從茶葉中萃取酯基兒茶素[10],以鄰苯二酚為片段模板萃取茶葉和果汁樣品中的多酚類物質[11]。Hou等[11]以多酚類物質兒茶素、綠原酸和咖啡酸中的共有結構鄰苯二酚為片段模板,2-苯胺為自聚合印跡涂層,利用硼酸親和印跡技術制備了中空多孔結構的FMIPs。中空結構有利于模板分子的去除,并能有效與靶分子結合,2-苯胺自聚合形成的涂層含有豐富的羥基,利于后續(xù)材料表面修飾及親水性提高。該FMIPs作為固相萃取填料高效地選擇性識別吸附了茶葉和果汁樣品中的上述3種多酚類物質。

2 虛擬模板印跡策略

虛擬模板印跡策略是采用在結構、形狀和大小及功能上與目標化合物相似的化合物作為模板進行印跡,制備出的聚合物通常稱為DMIPs。當原有的模板不易獲得,且造價昂貴或有毒時,除用上述的片段印跡策略外,也常用虛擬模板印跡策略,其可以有效避免模板泄漏造成的污染或對目標化合物分析結果造成影響等問題[12]。相比于片段印跡策略多用于生物分析,虛擬模板印跡策略適于各類目標物,在樣品前處理和傳感分析領域應用廣泛。

2.1 樣品前處理

MIPs在樣品前處理中,主要作為SPE的吸附劑,即分子印跡固相萃取(MI-SPE),用于選擇性萃取、富集、分離樣品中的目標分析物。MI-SPE主要包括常規(guī)SPE(裝柱SPE)、分散固相萃取(DSPE)、磁固相萃取(MSPE)和基質固相分散萃取(MSPD)。Zhang等[13]以棉糖代替氨基糖苷類抗生素作為模板分子,甲基丙烯酸為功能單體,三甲基丙烷三丙烯酸酯為交聯(lián)劑,采用沉淀聚合法制備了新型氨基糖苷類抗生素DMIPs。將此材料作為SPE填料并結合親水相互作用-高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HILIC-HPLC-MS/MS)技術,成功測定了環(huán)境水樣中6種痕量氨基糖苷類抗生素(硫酸鏈霉素、硫酸卡那霉素、硫酸安普霉素、硫酸慶大霉素、妥布霉素和硫酸帕洛莫霉素),富有應用潛力。Chen等[14]選擇與吡蟲啉和啶蟲脒具有一段相同結構的煙酰胺作為模板,以聚乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈為引發(fā)劑,采用表面印跡技術制備了DMIPs,用作SPE填料,高效富集了茶多酚中的痕量吡蟲啉和啶蟲脒。他們也分別合成了吡蟲啉和啶蟲脒作為模板的MIPs,發(fā)現(xiàn)DMIPs對這兩種農藥分子具有良好的吸附能力和選擇性。相比于傳統(tǒng)填料,MIPs填料以其高選擇性極大增強了SPE的富集效率,進而提高了后續(xù)分析的準確度。

近來,DMIPs在MSPE[15,16]和MSPD[17]中的應用持續(xù)增加。Zhang等[17]采用Pickering乳液聚合法以α-(2,4-二氯苯基)-1H-咪唑-1-乙醇(DCE)為模板合成了DMIPs,作為MSPD吸附劑用于魚樣品中唑類殺菌劑(攀緣唑、克霉唑和咪康唑)的前處理。MSPD萃取時間短,通過將DMIPs與樣品充分研磨,萃取劑與目標物可充分接觸,從而大大提高吸附萃取效果。

分子印跡膜(MIM)技術是一種將MIPs合成在多孔膜表面的技術。MIM具有合成簡便、成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)點,可以作為一種樣品前處理材料,從復雜基質中分離富集目標物。通過虛擬模板策略,可以克服MIM在使用過程中產生的模板泄漏問題,避免對后續(xù)檢測帶來影響,極大提高了MIM的性能和應用。田紅靜等[18]在聚偏氟乙烯膜表面,以環(huán)丙沙星的結構類似物恩諾沙星為虛擬模板、甲基丙烯酸為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑制備了恩諾沙星MIM,萃取牛奶樣品中的環(huán)丙沙星,結合儀器分析,快速檢測了牛奶中痕量環(huán)丙沙星殘留。將虛擬模板印跡策略與MIM相結合的制備方法為快速準確檢測復雜樣品中痕量目標物殘留提供了新思路。

2.2 傳感分析

傳感器主要由信號識別單元和信號轉換單元組成,基于MIPs的傳感分析,是指MIPs在傳感器中作為信號識別單元,特異性識別結合分析物后產生一定的信號,產生的信號被識別后得到分析數(shù)據(jù)。虛擬模板印跡策略的使用,一定程度上解決了MIPs在識別吸附目標物的過程中模板泄漏的問題,進一步提高了傳感器的檢測準確度和靈敏度,拓展了傳感器的應用范圍。

Li等[19]以磺胺苯(SZ)為虛擬模板,采用本體聚合法制備了能夠同時識別15種磺胺類藥物的DMIPs,將其作為識別試劑在常規(guī)的96孔微板上構建化學發(fā)光傳感器。傳感器可用于測定豬肉中15種磺胺類藥物的殘留量,檢出限為1.0～12 pg/mL,響應時間在30 min內,可重復使用4次以上。該傳感器可以大量篩查樣本,且操作簡單,選擇性強,靈敏度高,在快檢領域應用潛力巨大。

虛擬模板印跡策略也常與其他印跡策略相結合進行傳感分析。Huang等[20]將雙模板印跡策略和虛擬模板印跡策略結合,制備了MIPs化學發(fā)光傳感器,用于雞肉樣品中除蟲菊酯類農藥的檢測。以除蟲菊酯I和苯基醚為雙模板合成了用于除蟲菊酯類識別的雙-虛擬模板MIPs (DDMIPs)。將DDMIPs顆粒涂覆在96微板孔中,然后加入咪唑增強的雙(2,4,6-三氯苯酚)草酸-H2O2系統(tǒng)來誘導光信號。最后,利用化學發(fā)光強度的變化用于分析物定量測定。結果表明,該傳感器可重復使用4次。10種除蟲酯類農藥的檢出限為0.3～6.0 pg/mL,空白雞肉樣品的加標回收率為70.5%～99.7%。Guo等[21]利用量子點量子產率高、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點制備了量子點分子印跡熒光傳感器。以5,7-二甲氧基香豆素為虛擬模板,通過St?ber法制備了包覆CdTe量子點的DMIPs(MIP@CdTe QDs),利用量子點的發(fā)光特性制備了熒光傳感器,用于對黃曲霉毒素B1(AFB1)的快速特異性識別。研究表明,該傳感器與傳統(tǒng)的UPLC-MS測定的結果無顯著差異。該DMIPs傳感分析方法有望為快速檢測復雜基質中痕量外源有害物質開辟新途徑。

3 片段印跡和虛擬模板印跡策略的比較

片段印跡和虛擬模板印跡策略都不直接采用待測目標物作為模板,在一定程度上解決了MIPs使用過程中識別吸附不穩(wěn)定、模板泄漏、某些模板不易獲得等問題,極大拓展了MIPs的應用范圍。本文對兩種策略的異同點及優(yōu)缺點進行了總結(見圖2)。片段印跡策略對以細菌和病毒(傳染性強的物質)為模板的印跡過程操作條件更安全,因使用的模板尺寸較小,有利于創(chuàng)造更多印跡位點。虛擬印跡盡管解決了痕量分析中的模板泄漏問題,但有可能會導致識別選擇性降低,進而降低萃取效率。當選取的模板分子與目標物的某部分特定結構相同,但模板分子又是另一種不同的物質時,既可認作片段印跡策略也可認作虛擬模板印跡策略。若根據(jù)一類目標物的共有結構,篩選出理想的模板分子用于制備FMIPs/DMIPs,即可對一類具有共同結構的物質進行同時、選擇性富集和分離測定,實現(xiàn)高通量分析。

圖 2 片段印跡策略和虛擬模板印跡策略的基本示意圖及比較Fig. 2 Basic scheme and comparison of fragment imprinting strategy and dummy template imprinting strategy

4 結論與展望

盡管片段印跡策略和虛擬模板印跡策略在MIPs制備過程中應用廣泛,然而,目前仍存在以下4點主要問題亟待解決:在策略使用過程中,選擇或制備合適的片段模板和虛擬模板仍然有困難[22];如何確保制得的模板與原模板在吸附選擇性上幾乎沒有差異,確保理想的特異識別性;如何在制備和應用過程中使用環(huán)保試劑,減少環(huán)境污染,實現(xiàn)綠色化學的目標[23];通過實驗得到的材料如何進一步產業(yè)化,提高實用效果,以促進生產力發(fā)展。期待通過發(fā)展更多的制備策略和技術及其組合使用,能夠更快更好推進FMIPs/DMIPs在更多領域持續(xù)發(fā)展和高效應用。