王海云，王俏，王代明，朱健，朱虹

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院急診科,上海 200011;2.上海市公惠醫(yī)院內(nèi)科;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·臨床醫(yī)學(xué)院)

急性肺損傷(ALI)是由肺內(nèi)外各種因素導(dǎo)致的肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫。肺損傷的典型臨床表現(xiàn)為進行性呼吸困難和頑固性低氧血癥。近年來研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致ALI的重要發(fā)病機制[1]。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化、抗氧化系統(tǒng)失衡所引起的異常改變，組織器官的氧化應(yīng)激損傷是大多數(shù)疾病的病理生理基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激可產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基如果不能及時的清除，將對機體產(chǎn)生損傷。其中，活性氧(ROS)對生物膜脂質(zhì)過氧化損傷最為廣泛[2]。傳統(tǒng)活血化瘀中藥丹參臨床上常用于治療冠心病、心絞痛等疾病[3]。丹參多酚酸是中藥丹參的主要活性成分之一，丹參多酚酸鹽能保護心血管系統(tǒng)，具有擴張血管等作用[4-5]。本研究擬觀察丹參多酚酸鹽對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷的影響及對炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的調(diào)節(jié)，探討丹參多酚酸鹽保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自Gibco公司；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；CCK8試劑盒購自美國Selleck公司；Trizol試劑購于Invitrogen公司；PrimeScript RT Reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自Takara公司。丹參多酚酸鹽購自上海綠谷制藥有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)完全溶解復(fù)蘇后將其配制成細胞懸液，RPMI 1640 完全培養(yǎng)基在37 ℃的5%二氧化碳培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液，在細胞呈單層貼壁生長后延長至每2至3天換液，多次換液培養(yǎng)至細胞生長融合達90%。

1.3 細胞傳代 取出HUVEC細胞，PBS洗盡殘留培養(yǎng)基，加入0.25%胰酶，用含10%胎牛血清的RPMI 1640終止消化。無菌吸管輕輕吹打，制成細胞懸液，加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，平均分在不同的培養(yǎng)皿中。

1.4 實驗分組 將貼壁的HUVEC細胞分成3組，對照組，H2O2組(H2O2200 μmol/L處理)和丹參多酚酸鹽組(丹參多酚酸鹽100 mg/L +H2O2200 μmol/L處理)。

1.5 CCK8法檢測細胞增殖 按104/孔的密度將細胞種于96孔板中，體積為100 μL，24 h細胞貼壁后，細胞分成3組，處理不同的時間后分別加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃避光孵育30 min，檢測450 nm吸光度，與對照孔比較計算細胞存活率。每日在相同時間點檢測，共檢測7 d。

1.6 紫外分光光度法測定HUVEC細胞MDA含量和SOD活性水平 三組HUVEC細胞分別處理72 h后，用PBS輕輕清洗細胞2次，加入細胞裂解液并刮取細胞，于4 ℃用1.2×104r/min離心10 min后取上清，BCA法測定蛋白含量。分別利用MDA及SOD比色法試劑盒檢測HUVEC細胞蛋白上清液中的MDA含量及SOD的活性。

1.7 qRT-PCR檢測HUVEC細胞IL-6、IL-1β、TNF-α及Nrf2的表達 根據(jù)NCBI上公布的各基因序列分別設(shè)計qRT-PCR用引物：IL-6 F/R:5′-CTTCTCCACAAGCGCCTTCG-3′，5′-TTCTCAGGGCTGAGATGCCG-3′；IL-1βF/R:5′-GGCCCTAAACAGATGAAGTGC-3′，5′-CCAGCATCTTCCTCAGCTTG-3′；TNFαF/R:5′-CCCAGGGACCTCTCTCTAATCA-3′，5′-AGCTGCCCCTCAGCTTGAG-3′；Nrf2 F/R:5′-TGCCAACTACTCCCAGGTTG-3′，5′-AGACTGGGCTCTCGATGTGA-3′；GAPDH F/R：5′-GTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；并由上海生物工程有限公司代為合成。三組HUVEC細胞分別處理72 h后，Trizol法提取細胞中的總RNA。根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，步驟按照試劑盒的說明進行。各基因?qū)?yīng)上下游引物各0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，cDNA模板1.0 μL，滅菌雙蒸水8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，35個循環(huán)；65 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，選取GAPDH為內(nèi)參基因。采用2-△△CT表示各基因的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 丹參多酚酸鹽對H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細胞增殖的影響 CCK8實驗的結(jié)果表明，從第2天開始(F=19.199，P<0.01)至第7天(F=143.709，P<0.01)三組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較，從第2天開始至第7天，H2O2(200 μmol/L)能顯著抑制HUVEC的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);應(yīng)用丹參多酚酸鹽(100 mg/L)處理后，能顯著逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細胞生長增殖抑制,提高細胞存活率(P<0.05)。見圖1。

注： H2O2為過氧化氫，HUVEC為人臍靜脈內(nèi)皮細胞，下圖和表同；與對照組比較，aP<0.01；與H2O2組比較，bP<0.05

2.2 丹參多酚酸鹽對H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細胞MDA含量和SOD活性水平的影響 分別處理72 h后，三組細胞之間的MDA(F=149.913,P<0.01)和SOD(F=123.760,P<0.01)的含量水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。H2O2組與對照組比較，H2O2(200 μmol/L)能誘導(dǎo)HUVEC細胞MDA含量顯著增加(t=14.501,P<0.01)，降低 SOD的活性水平(t=15.931,P<0.01)。丹參多酚酸鹽組與H2O2組比較，應(yīng)用丹參多酚酸鹽(100 mg/L)能明顯降低HUVEC細胞的MDA水平(t=14.794,P<0.01)，提高SOD水平(t=11.819，P<0.01)。說明應(yīng)用丹參多酚酸鹽(100 mg/L)處理后能顯著降低H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細胞MDA含量的增加，并能提高細胞SOD的活性水平。見表1。

表1 丹參多酚酸鹽對H2O2誘導(dǎo)HUVEC細胞MDA 和SOD的影響

2.3 丹參多酚酸鹽對H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細胞IL-6、IL-1β和TNF-α表達的影響 HUVEC細胞分別處理72 h后，三組細胞內(nèi)IL-6(F=111.167，P<0.01)、IL-1β(F=278.121，P<0.01)和TNF-α(F=80.618，P<0.01) 的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義。分組比較發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，H2O2(200 μmol/L)能顯著誘導(dǎo)HUVEC細胞IL-6(t=16.819，P<0.01)、IL-1β(t=26.181，P<0.01)和TNF-α(t=9.987，P<0.01)的表達增加；與H2O2組相比，應(yīng)用丹參多酚酸鹽(100 mg/L)處理后能顯著降低H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細胞IL-6(t=4.248，P<0.01)、IL-1β(t=14.864，P<0.01)和TNF-α(t=7.822，P<0.01)的表達增加。見圖2。

2.4 丹參多酚酸鹽對H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細胞Nrf2表達的影響 三組HUVEC細胞分別處理72 h后，細胞內(nèi)Nrf2的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16 858.879，P<0.01)。分組比較發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，H2O2組細胞Nrf2表達的增加 (t=36.941，P<0.05)；與H2O2組相比，丹參多酚酸鹽組顯著提高了HUVEC細胞Nrf2的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=167.473，P<0.01)。見圖3。

注：IL-6為白細胞介素-6，IL-1β為白細胞介素-1β，TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與對照組比較，aP<0.01；與H2O2組比較，bP<0.01

注：Nrf2為核因子E2相關(guān)因子；與對照組比較，aP<0.05；與H2O2組比較，bP<0.01

3 討論

MDA是生物體內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一,具有細胞毒性，MDA含量增多可加劇膜的損傷。通過SOD和MDA含量可反映細胞氧化應(yīng)激受損的程度[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，用H2O2處理HUVEC細胞后能明顯增加細胞MDA表達的增加，并顯著降低細胞SOD的活性水平，說明H2O2可誘導(dǎo)HUVEC細胞的氧化應(yīng)激損傷。應(yīng)用丹參多酚酸鹽處理后能顯著降低細胞MDA含量，并能顯著增加細胞SOD的水平，說明丹參多酚酸鹽能有效抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，保護血管內(nèi)皮細胞。同時發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用丹參多酚酸鹽處理后能顯著逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細胞的生長增殖抑制,提高細胞的存活率。有臨床研究表明丹參多酚酸鹽能降低冠心病患者MDA水平，增加SOD水平，有利于改善冠心病患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)[7]，表明丹參多酚酸鹽具有抗氧化應(yīng)激的作用，能保護血管內(nèi)皮細胞免受氧化應(yīng)激的損傷。

氧化應(yīng)激不僅損傷血管內(nèi)皮細胞，而且還能增加炎性細胞因子的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理HUVEC細胞發(fā)生氧化應(yīng)激后，能使細胞內(nèi)炎性細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達顯著增加。有研究表明，這些炎癥相關(guān)的介質(zhì)可導(dǎo)致患者小氣道損傷與肺泡組織的破壞，從而逐漸出現(xiàn)呼吸功能障礙[8]。在應(yīng)用丹參多酚酸鹽處理后，能顯著降低HUVEC細胞中這些炎性因子的表達，說明丹參多酚酸鹽可以抑制H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞炎癥介質(zhì)的過量表達和釋放，從而減輕炎性反應(yīng)保護肺損傷。石清等[9]報道，丹參多酚酸鹽聯(lián)合氯吡格雷改善急性冠脈綜合征患者心功能和內(nèi)皮功能，降低炎性因子。穆德廣等[10]利用急性肺損傷兔模型也證實，丹參多酚酸鹽能降低TNF-α、IL-1的水平。這些結(jié)果表明丹參多酚酸鹽能抑制炎性因子的表達和釋放，減輕炎癥級聯(lián)反應(yīng)。

Nrf2信號通路是調(diào)控氧化應(yīng)激的主要信號通路[11]。激活的Nrf2進入細胞核與特異的DNA序列結(jié)合，持續(xù)激活SOD等酶的表達，抑制血管內(nèi)皮細胞活性氧的過量產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的保護作用[12]。本研究顯示H2O2能誘導(dǎo)HUVEC細胞氧化應(yīng)激的過程中Nrf2的表達增加，應(yīng)用丹參多酚酸鹽后能顯著提高Nrf2的表達，說明丹參多酚酸鹽能通過增加Nrf2的表達發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，保護血管內(nèi)皮細胞。

綜上所述，H2O2能誘導(dǎo)HUVEC細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷及增加炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，丹參多酚酸鹽能對H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細胞的氧化應(yīng)激損傷及炎性因子的過度表達發(fā)揮抑制作用，其機制可能與丹參多酚酸鹽能誘導(dǎo)HUVEC細胞上調(diào)Nrf2的表達有關(guān)。