王天亮，于志民

(1.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱 150001； 2.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱 150040)

刺五加[Eleutherococcussenticosus(Rupr.&Maxim.)Maxim.]別名刺拐棒、坎拐棒子、五加皮等，具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神之功效[1-2]，是重要的中藥材之一、東北地區(qū)典型的藥用植物、北藥中緊缺的寶貴中藥材，味辛、性溫、微苦、無毒?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》[3]《本草綱目》[4-5]等古代藥學(xué)專著對其都有相關(guān)記載。刺五加主要分布于我國東北地區(qū)及俄羅斯西伯利亞，日本和朝鮮也有分布，散生或叢生于山地闊葉混交林緣、林下及采伐地上[6]。刺五加的根、根莖、莖、葉和果實(shí)均可入藥，嫩葉可食用，作為藥膳?，F(xiàn)代藥理證明，刺五加在提高免疫力、防血栓、保護(hù)心臟及調(diào)節(jié)神經(jīng)中樞系統(tǒng)等方面具有廣泛的藥理作用[7]。刺五加在國外應(yīng)用也十分廣泛[8]。近年來，隨著我國中藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，對刺五加原材料的需求量也逐年遞增，致使野生資源逐年銳減。為了緩解中藥材原料短缺問題，我國在人工栽培刺五加方面進(jìn)行了研究并取得了一定成績[9-11]，隨著人工栽培面積的不斷擴(kuò)大，一些制約發(fā)展的瓶頸問題急需解決，如刺五加黑斑病。黑斑病是刺五加栽培生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，發(fā)病會導(dǎo)致其產(chǎn)量和質(zhì)量下降，影響其藥用價值。為獲得優(yōu)質(zhì)道地的刺五加原料，開展刺五加病原學(xué)探索，找出發(fā)病機(jī)制，抑制藥劑篩選，這些研究十分必要。對國內(nèi)外刺五加黑斑病研究方向進(jìn)行分析，并對未來研究趨勢進(jìn)行了展望。

1 刺五加黑斑病病原學(xué)研究

1.1 黑斑病病原菌鑒定

有研究人員[12]參照張?zhí)煊頪13]方法，對刺五加葉片上的黑斑病原菌進(jìn)行了分離純化，并從形態(tài)學(xué)方面做了分析鑒定。寄主植物上，成熟的分生孢子為褐色，單生或串生，倒棍棒形，倒梨形，直立或略有屈膝，具3～8個橫隔膜或半橫隔膜，淡褐色，為2.0～5.1×10.4～47.7 μm。部分孢身底部逐漸延伸為長短不等的柱狀假喙。分生孢子梗淡褐色至深褐色，基部細(xì)胞略膨大，單生或簇生，偶有分支，直立，少有彎曲，有隔膜，長度變化較大，寬度變化較小，為3.0～6.0×25.0～75.0 μm。病原菌在PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2 d，即可長出白色絲狀菌落，隨著生長，菌落變?yōu)榫G色。菌落邊緣整齊，為灰白色菌絲，25℃光暗交替培養(yǎng)15 d以上后，產(chǎn)孢子。分生孢子顏色加深，孢子大小無變化，喙一部分縮短變粗轉(zhuǎn)化為次生分生孢子。在PCA培養(yǎng)基上，菌落呈灰白色，氣生菌絲較少，邊緣整齊。在PCA+濾紙上光暗交替培養(yǎng)9 d后，產(chǎn)生分生孢子鏈。長鏈著生分生孢子梗上，偶有孢子萌發(fā)形成側(cè)鏈。孢子形態(tài)與寄主植物上略微有變化，孢子大小有較大變化。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，初步判定該菌為鏈格孢屬細(xì)極鏈格孢[Alternaria.tenuissima (Fr) Wiltshire][14]。

支葉[12]等利用序列比對分析方法，對黑斑病進(jìn)行了病原菌分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，菌株A,tenuissima isolate CWZ-12的序列與GenBank中的A.tenuissima isolate XSD-83(登錄號:EU326185)的遺傳距離最近，位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支。

1.2 黑斑病病原菌發(fā)病機(jī)制

刺五加黑斑病原菌傳染性極強(qiáng)，在人參、藍(lán)莓、五味子、黃瓜、茄子、紫薯、燕麥、玉米等植株發(fā)病葉片中均可分離得到刺五加黑斑病原菌，發(fā)病程度以菊科、薔薇科植株嚴(yán)重，病斑癥狀接近病原菌侵染刺五加的癥狀[12]。

刺五加黑斑病發(fā)病時間集中在6～8月，低溫高濕等適宜環(huán)境下易發(fā)病，主要危害葉片。其從下部葉正面開始侵染，病斑初期為黑色小斑，逐步擴(kuò)大至左右的近圓形大斑，外圍為黑色水漬狀，后期嚴(yán)重時擴(kuò)大為13～15 mm不規(guī)則型病斑連片，中間干枯穿孔。從其發(fā)病條件可以明確，發(fā)病誘因與環(huán)境水熱條件、營養(yǎng)類型等密不可分。魏書琴[15-16]等通過研究發(fā)現(xiàn)，碳源吸收能力從低至高依次為多糖<二糖<單糖。氮源中，對真蛋白質(zhì)類的吸收能力最強(qiáng)。5℃～35℃均可生長，20℃～30℃下生長較為迅速。在pH 2～12下，病原菌均可以生長，pH 6時最適生長。連續(xù)紫外燈照射的菌落長勢最好。魏書琴等對黑斑病孢子萌發(fā)條件進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，刺五加黑斑病菌在5℃～25℃孢子萌發(fā)率與溫度呈正相關(guān)，在高于25℃條件下，病原菌孢子萌發(fā)率下降，證明該病原菌孢子萌發(fā)的最適溫度為25℃，但其在60℃以下的溫度條件下均可以存活[17-19]。在水滴和相對濕度為93%時，萌發(fā)率較高，濕度越低，萌發(fā)率越低，這充分證明刺五加黑斑病發(fā)病因素是多方面的，既與周圍環(huán)境光熱、水分等條件有關(guān)，又與寄主植物自身成分結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，這些因素變化將直接決定發(fā)病幾率，為深入研究預(yù)防病原菌發(fā)病技術(shù)和方法提供了理論基礎(chǔ)。

2 抑菌藥劑篩選研究

魏書琴[20]等研究結(jié)果表明，10%世高水分散劑、30%福嘧霉懸浮劑、50%撲海因WP和20%黑星葉霉唑超微WP對刺五加黑斑病的抑菌效果最佳。關(guān)天舒[21]等篩選出33.5%哇琳酮SC和32.5%嘧菌酯及苯醚甲環(huán)唑SC，在使用劑量很低的情況下即可達(dá)到很好的抑制效果。劉暢[22]等研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的39種藥劑具有刺五加黑斑病菌室內(nèi)抑菌作用。氟菌唑在室內(nèi)抑菌測定和田間藥效試驗(yàn)結(jié)果中，在試驗(yàn)劑量下對刺五加黑斑病均有明顯的防治效果，田間效果可達(dá)67.86%～80.62%。

3 展望

研究表明，高光譜成像技術(shù)的準(zhǔn)確精度可以達(dá)到92.77%，是發(fā)病初期重要的發(fā)現(xiàn)和防止手段[23]，但由于此類真菌絕大多數(shù)缺乏有性階段[24]，相較傳統(tǒng)正向遺傳學(xué)手段，基因突變或敲除等反向遺傳學(xué)方法成為必然。研究發(fā)現(xiàn)，對部分目標(biāo)基因進(jìn)行突變或敲除，致病力并未變化，這可能與基因存在功能冗余有關(guān)[25-26]，為中藥材基因防病技術(shù)提供了思路和參考。

在黑斑病藥劑篩選方面，由于具有環(huán)境友好、對非靶標(biāo)生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，植物源殺菌劑逐漸成為熱點(diǎn)之一[27-29]，相關(guān)研究報道屢見不鮮[30-32]。有報道稱，針對鏈格孢菌(Alternaria alternata)，肉桂皮、百里香、丁香、檸檬草和玫瑰草等植物精油具有顯著的抑菌活性[33]。國外有研究顯示，采用殺真菌劑進(jìn)行防治的生物功效正在減小，通過提高植物本身防御代謝調(diào)控來誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗病性，或?qū)⒊蔀橐环N創(chuàng)新嘗試手段。