智雅婧 馮鐵虹 那順孟和 鄭媞

肺腺癌惡性程度高，是臨床臨床診治困難的疾病之一。目前肺腺癌的發(fā)生及病程中相關(guān)分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不夠深入，因此尋找新的生物標(biāo)志物對(duì)提高肺腺癌的診斷率，對(duì)改善患者預(yù)后意義重大。磷脂酰肌醇蛋白聚糖（glypicans，GPC）是一類由蛋白質(zhì)、糖和脂質(zhì)組成的復(fù)雜的復(fù)合物，有學(xué)者研究報(bào)道其與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系［1］。隨著較多學(xué)者對(duì)微小RNA（microRNA，miRNA）的探究的，發(fā)現(xiàn)miRNA-9 在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)天冬氨酸特異性半膚氨酸蛋白酶（Cysteinyl Aspartatespecific Proteninases，Caspase）是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)14 種亞型［3］。本研究旨在探討GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 在肺腺癌中的表達(dá)及與病情、預(yù)后生存的相關(guān)性，現(xiàn)研究報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年8月至2017年8月本院收治的76 份肺腺癌患者標(biāo)本為觀察組，其中男39 例，女37；平均年齡（60.51±3.57）歲；根據(jù)TNM 分期，可分為Ⅰ期～Ⅱ期33 例，Ⅲ～Ⅵ期43 例。選取上述患者遠(yuǎn)離3cm 的肺腺癌的癌旁正常組織76 分標(biāo)本作為對(duì)照組。所有患者知情同意。整理并分析其臨床資料。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)術(shù)后病理檢查及術(shù)前影像檢查確診為肺腺癌［4］；②納入研究前未接受過(guò)放、化療等輔助治療；③年齡在51～78 歲之間。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤及重要器官嚴(yán)重疾病者；②因精神障礙無(wú)法配合治療者；③阿爾茲海默癥者。

1.2 GPC-1、Caspase-3 檢測(cè)方法

免疫組化法：標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟切片、脫水，加入酒精、自來(lái)水沖洗、顯色、復(fù)染、脫水中性樹(shù)膠封固。在顯微鏡下觀察GPC-1、Caspase-3，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明進(jìn)行，檢測(cè)完成后由2 位高年資醫(yī)師采用雙盲法閱片。

1.3 miRNA-9 檢測(cè)方法

取出組織標(biāo)本置于新的EP 管家1 mLTrizol 裂解液。離心、取上清留取2 μL 用于RNA 質(zhì)量檢測(cè)，其余RNA 溶液放置-80℃冰箱備用?？俁NA特異的莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配置。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)提取兩組組織中的RNA，miRNA-9 序列：5′-GTTATCTAGCTGTATGAGTGCC-3′。樣品做3 個(gè)平行孔，取其均數(shù)。相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt計(jì)算［5］。ΔΔCt=（Ct 目的基因-Ct管家基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct 目的基因-Ct 管家基因）對(duì)照組。

1.4 試劑選擇

兔抗人GPC-1 多克隆抗體由北京博奧森生物技術(shù)公司提供；Caspase-3 鼠抗人單克隆抗體采購(gòu)自美國(guó)Neo Markers 公司；miR-9mimics 及所用引物購(gòu)自中國(guó)廣州銳博生物科技有限公司。

1.5 結(jié)果判定

GPC-1、Caspase-3 陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)［6］：腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。陽(yáng)性細(xì)胞占比：0 分（無(wú)陽(yáng)性）；＜30.00%（1 分）；≥30.00%（2 分）。染色強(qiáng)度評(píng)分：0 分（無(wú)色）、1 分（淡黃色）、2 分（棕黃色）、3 分（棕褐色）。陽(yáng)性細(xì)胞＜26%為1 分，陽(yáng)性細(xì)胞占比26%～50%為2 分，陽(yáng)性細(xì)胞占比51%～75%為3 分，陽(yáng)性細(xì)胞＞75%為4 分；根據(jù)兩者相乘結(jié)果進(jìn)行評(píng)判：小于3 分（-）、3 分（+）、4 分（++）、5 分（+++）。陽(yáng)性率=陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)×100%。miRNA-9 正常范圍值：2.35～4.62 ng/mL［7］。

1.6 隨訪

本研究隨訪（患者自行來(lái)院復(fù)查）從患者術(shù)后開(kāi)始，直至患者死亡或本研究的隨訪結(jié)束，為期3年，截止于2020年8月?；颊叩碾S訪時(shí)間分布在1 至36 個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為（20.10±2.64）個(gè)月。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；繪制ROC 曲線，Kaplan-Meier 生存分析GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表達(dá)對(duì)患者預(yù)后生存的影響，以tarone 法進(jìn)行檢驗(yàn)；影響患者預(yù)后的相關(guān)因素采用Logistic回歸分析；以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 在不同組織中的表達(dá)

肺腺癌組織中GPC-1、Caspase-3 陽(yáng)性表達(dá)及miRNA-9 高表達(dá)率高于癌旁正常組織（P＜0.05）。見(jiàn)表1，圖1。

表1 GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 在不同組織中的表達(dá)［n（%）］Table 1 expression of GPC-1，mirna-9 and Caspase-3 in different tissues［n（%）］

圖1 免疫組化染色圖（×500）Figure 1 immunohistochemical staining（×500）

2.2 肺腺癌組織中GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3表達(dá)與患者病情進(jìn)展的關(guān)系

GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表達(dá)情況與肺腺癌患者年齡、性別、分化程度、腫瘤直徑、血管侵犯無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 肺腺癌組織中GPC-1、miRNA-9、Caspase-3 表達(dá)與患者病情進(jìn)展的關(guān)系Table 2 Relationship between the expression of GPC-1，mirna-9，Caspase-3 in lung adenocarcinoma and the progression of patients

2.3 肺腺癌患者不同GPC-1、miRNA-9及Caspase-3表達(dá)的預(yù)后情況

納入的76 例肺腺癌患者3年生存率為35.53%（49/76），GPC-1 陽(yáng)性表達(dá)、miRNA 高表達(dá)、Caspase-3 陰性表達(dá)的肺腺癌患者死亡率更高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 肺腺癌患者不同GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表達(dá)的預(yù)后情況［n（%）］Table 3 Prognosis of lung adenocarcinoma patients with different expression of GPC-1，mirna-9 and caspase-3［n（%）］

2.4 GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

GPC-1 表達(dá)陰性及表達(dá)陽(yáng)性中位生存時(shí)間分別為（36.01±2.26）個(gè)月、（30.22±1.71）個(gè)月；miRNA-9 高表達(dá)及低表達(dá)中位生存時(shí)間分別為（29.69±1.40）個(gè)月、（35.86±2.63）個(gè)月；Caspase-3 表達(dá)陰性及表達(dá)陽(yáng)性中位生存時(shí)間分別為（27.42±1.66）個(gè)月、（34.51±1.96）個(gè)月。生存分析顯示GPC-1（表達(dá)陰性）、miRNA-9（低表達(dá)）、Caspase-3（陽(yáng)性表達(dá)）者生存期較長(zhǎng)，Keplan-meier 生存曲線明顯不同（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.5 影響肺腺癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析

圖2 生存曲線Figure 2 survival curve

臨床分期（Ⅲ～Ⅵ期）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、GPC-1 表達(dá)（陽(yáng)性）、miRNA（高表達(dá)）及Caspase-3 表達(dá)（陰性）為影響肺腺癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

肺腺癌早期無(wú)典型癥狀，且尚無(wú)特異且敏感的標(biāo)志物，絕大多數(shù)的患者無(wú)法及時(shí)確診，因此耽誤最佳治療時(shí)機(jī)，即使患者得到手術(shù)根治，也需要面臨高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率的風(fēng)險(xiǎn)。如何提高肺腺癌的早期診斷率，改善預(yù)后為當(dāng)前肺腺癌治療亟待解決的難題。

國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)［8］，GPC-1、Caspase-3 在肺腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率有較大差異，本研究發(fā)現(xiàn)在肺腺癌組織中GPC-1 陽(yáng)性表達(dá)率、Caspase-3 陰性表達(dá)率、miRNA-9 高表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織?？紤]與納入樣本量不同有關(guān)，免疫組化抗原修復(fù)方式也存在差異，可能會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定偏差。

相關(guān)研究指出［9］，GPC-1 與肺腺癌相關(guān)，GPC-1陽(yáng)性表達(dá)與肺腺癌淋巴結(jié)的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其在肺腺癌發(fā)生過(guò)程中起到一定作用。本研究證實(shí)GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 的表達(dá)與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

表4 影響肺腺癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析Table 4 univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with lung adenocarcinoma

GPC-1 在生長(zhǎng)發(fā)育和癌變過(guò)程中起關(guān)鍵作用，Xue F［10］等學(xué)者研究指出，GPC-1 在非癌組織中無(wú)表達(dá)或表達(dá)量極低，但在癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)。Szychowski KA［11］等指出，GPC-1 在肝癌、胰腺癌等惡性疾病中陽(yáng)性表達(dá)率較高。miRNA-9是是一種古老的小分子RNA，有較多研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、胃癌等腫瘤中呈異常表達(dá)，且參與了腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，而由于腫瘤類型和下游作用靶點(diǎn)的不同miRNA-9 可作為促癌基因也可作為抑癌基因［12～13］。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-9 高表達(dá)中位生存時(shí)間明顯短于miRNA-9 低表達(dá)者，提示其在肺腺癌中作為促癌基因發(fā)揮作用，促進(jìn)了癌細(xì)胞的增值和擴(kuò)散。Caspase-3 以低活性酶原形式廣泛存在于細(xì)胞中，TNM 分期Ⅲ～Ⅵ的的肺腺癌患者Caspase-3 表達(dá)下調(diào)，可見(jiàn)Caspase-3 表達(dá)降低可能與參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程［14～15］。

本研究中肺腺癌患者3年生存率為僅35.53%，生存分析顯示，生存分析顯示GPC-1（表達(dá)陰性）、miRNA-9（低表達(dá)）、Caspase-3（陽(yáng)性表達(dá)）者生存期較長(zhǎng)，提示：GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 的異常表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后相關(guān)。經(jīng)非條件多因素Logistic 回歸模型進(jìn)一步分析，再次肯定GPC-1、miRNA、Caspase-3 這三者在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。但由于本研究本研究研究年限較短，且納入樣本量較少，研究結(jié)果難免存在偏倚，GPC-1、miRNA、Caspase-3 這三者聯(lián)合檢測(cè)是否有望成為更敏感且準(zhǔn)確的指標(biāo)仍有待研究。

綜上所述，GPC-1、miRNA、Caspase-3 異常表達(dá)與肺腺癌患者病情進(jìn)展密切相關(guān)，且不利于患者預(yù)后。提示臨床工作者可通過(guò)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)這三項(xiàng)指標(biāo)，以了解肺腺癌患者疾病進(jìn)展情況，以評(píng)估患者預(yù)后。