張建平 李紅燕 王大望 劉莎莉 馬艷俠

結(jié)核分枝桿菌復合群（M.tuberculosiscomplex，MTB）共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，對大多數(shù)抗結(jié)核藥物的自然耐受性相近，臨床上結(jié)核病的病原菌多為人型結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。結(jié)核病是一種嚴重危害人民健康的慢性傳染病，我國是結(jié)核病高負荷國家，耐藥情況嚴重，在結(jié)核病防控工作中結(jié)核菌檢查對于發(fā)現(xiàn)傳染源、確定診斷和化療方案、考核療效、評價防治效果具有重要意義［1］。結(jié)核菌的實驗室檢驗技術(shù)涵蓋病原學檢測、免疫學檢測、分子生物學檢測及生物化學檢測。包括痰涂片鏡檢、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、結(jié)核抗體、γ-干擾素釋放試驗/T-Sport，分枝桿菌核酸檢測（TB-NTM-PCR）等［2］。痰涂片鏡檢陽性率低，傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法及藥敏試驗檢出結(jié)果時間長，不能滿足臨床需要，而肺外標本采用傳統(tǒng)方法診斷較為困難，涂陰培陰的結(jié)核患者占73.6%，因此迫切需要能快速、準確檢測結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的診斷技術(shù)。近年來隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，分枝桿菌核酸PCR、實時熒光RNA 恒溫擴增檢測（SAT）、Xpert 結(jié)核分枝桿菌/利福平快速分子鑒定（Mycobaeterium tuberculosis/Rifampicin，MTB/RIF）、線性探針、基因芯片等新的檢驗方法也不斷應(yīng)用于臨床［3］。本研究對肺結(jié)核病患者的痰標本分別采用直接涂片抗酸染色（Z-N 法）、結(jié)核桿菌MGIT 液體培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF方法進行檢測，現(xiàn)分析報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至2018年9月在本院傳染病院住院的確診肺結(jié)核病患者116 例，納入標準：參照WS 288-2017 肺結(jié)核診斷標準［4］，依據(jù)臨床表現(xiàn)、胸部影像學及實驗室檢查。其中結(jié)核桿菌MGIT液體培養(yǎng)陽性72 例，男51 例，女21 例，年齡16～90歲，平均年齡50.6 歲，男女性別比2.43∶1。培養(yǎng)陰性44 例，男31 例，女13 例，年齡21～88 歲，平均年齡49.5 歲，男女性別比2.38∶1。排除標準：影像學及實驗室檢查均排除非結(jié)核分枝桿菌肺病及其它肺部疾病。實驗采用研究對象的痰標本，研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會同意，免于簽署患者知情同意書。

1.2 標本采集

收集3 份痰標本（當日即時痰、夜間痰和次日晨痰）?；颊哂们逅诤?，深吸氣2～3 次，每次用力呼出，從肺部深處咳出第2、3 口痰液收集于樣本容器，擰緊盒蓋送檢。對當日不能檢測的痰標本置于4℃冰箱保存，不超過12 h，要求標本量一般3～5 mL，標本采集前均未使用抗結(jié)核藥物治療［4］。

1.3 儀器與試劑

采用全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)（美國Cepheid公司，型號：GeneXpert）、全自動分支桿菌培養(yǎng)監(jiān)測儀（美國BD 公司，型號：BACTEC MGITTM320）、生物顯微鏡（德國Leica 公司，型號：MD1000）。Xpert MTB/RIF 檢測試劑盒（美國Cepheid 公司）、BBLTMMGITTM培養(yǎng)管（美國BD 公司）、分枝桿菌聯(lián)合藥敏試劑盒（美國BD 公司）、抗酸染色試劑盒（珠海貝索公司）。

1.4 檢測方法

1.4.1 直接涂片抗酸染色

對3 份痰標本采用萋尼染色法（Z-N 法），參照WS 288-2017 肺結(jié)核診斷、《中國結(jié)核病防治規(guī)劃。痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》進行標準化操作及質(zhì)量控制，涂片陽性結(jié)果定義為至少兩份標本判斷為陽性［4-5］。

1.4.2 MGIT 液體培養(yǎng)

對3 份混合痰標本用2% N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH 進行處理，將處理后的標本接種于含營養(yǎng)添加劑及抑制劑的MGIT 液體培養(yǎng)管，放入BACTEC MGITTM320 儀器自動檢測，通過分析熒光強度判斷是否有結(jié)核MTB 生長，一般快速7～14 d 培養(yǎng)陽性，培養(yǎng)周期設(shè)定42 d。

1.4.3 MGIT 聯(lián)合藥敏試驗

使用MGIT 陽性1 天的懸浮培養(yǎng)液，按照藥敏試劑盒接種程序操作，4～13 d 內(nèi)通過分離菌株在含藥培養(yǎng)管和生長對照管的對比確定藥物敏感性結(jié)果。

1.4.4 Xpert MTB/RIF 技術(shù)

取1 mL 混合痰標本加入2 mL 樣本處理液，按照操作規(guī)程將處理后的樣本加入檢測盒，置于GeneXpert 檢測模塊自動檢測。該技術(shù)采用巢式實時熒光定量PCR，針對結(jié)核分枝桿菌rpoB基因81 bp 利福平耐藥核心區(qū)（rifampin resistance determining region，RRDR）設(shè)計引物、探針，檢測其是否突變。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用Pearson 卡方檢驗，采用McNemar 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3 種檢測方法陽性率比較

3 種檢測方法陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3 種檢測方法陽性率比較［n（%）］Table 1 Comparison of positive rate of 3 methods［n（%）］

2.2 MGIT 液體培養(yǎng)與Xpert MTB 結(jié)果比較

MGIT 液體培養(yǎng)與Xpert MTB 結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。以臨床確診為診斷標準，Xpert 法靈敏度90.3%，特異度77.3%，陽性預測值86.7%，陰性預測值82.9%，Youden 指數(shù)0.676，總符合率85.3%。見表2。

表2 MGIT 液體培養(yǎng)與Xpert MTB 結(jié)果比較［n（%）］Table 2 MGIT liquid culture and XPERT MTB results comparison［n（%）］

2.3 Xpert MTB 與Z-N 法結(jié)果比較

Xpert MTB 與Z-N 法結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 Xpert MTB 與Z-N 法結(jié)果比較［n（%）］Table 3 Xpert MTB and Z-N results comparison［n（%）］

2.4 Xpert MTB/RIF rpoB 基因檢測結(jié)果

75 例Xpert MTB/RIFrpoB基因檢測結(jié)果分析，66 例Xpert MTB/RIFrpoB基因未檢出突變，即未檢測到RIF 耐藥，與MGIT 聯(lián)合藥敏試驗利福平敏感結(jié)果一致，9 例Xpert MTB/RIFrpoB基因突變被檢出，為RIF 耐藥，而藥敏試驗為利福平敏感，總符合率88.0%（66/75）。見表4。

表4 Xpert 利福平rpoB 基因檢測結(jié)果［n（%）］Table 4 The results of Xpert rpoB gene［n（%）］

3 討論

結(jié)核桿菌耐藥表型及耐藥基因型關(guān)系的確立，為基于利福平耐藥基因rpoB突變?yōu)榘悬c的診斷奠定了基礎(chǔ)［6］。Xpert MTB/RIF 以5 條引物探針選擇性覆蓋結(jié)核分枝桿菌特有的序列rpoB基因81 bp 上RRDR，第6 條探針用做內(nèi)部質(zhì)量控制，以檢測標本是否含有結(jié)核分枝桿菌復合群（MTB）以及利福平是否耐藥［7］。

WHO 推薦Xpert MTB/RIF 對成人疑似多重耐藥結(jié)核或HIV 相關(guān)肺結(jié)核初篩診斷，Xpert MTB/RIF 檢測結(jié)核分枝桿菌靈敏度高［8］。據(jù)報道，抗酸染色法通常需5 000 CFU/mL 才能得到陽性結(jié)果，而Xpert MTB/RIF 方法的檢測限（LoD）為131 CFU/mL，尤其在MTB DNA 低拷貝時，抗酸染色法往往是陰性結(jié)果。本研究顯示，痰直接涂片抗酸染色法的陽性率遠遠低于Xpert MTB 與MGIT液體培養(yǎng)陽性率，而Xpert MTB 與MGIT 液體培養(yǎng)陽性率接近。直接痰涂片陽性率低，容易漏檢，也和未采用濃縮集菌法涂片、熒光染色鏡檢以及與工作人員的涂片質(zhì)量和閱片技能有一定關(guān)系［9］。

國外有報道，Xpert MTB/RIF 試驗在痰涂片陽性的標本中，其敏感性接近100%，本文的研究結(jié)果與其一致［10］。文獻報道，傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)陽性率為44.5%，培養(yǎng)時間約6～8 周，MGIT 液體培養(yǎng)陽性率為62.1%，7～14 天培養(yǎng)陽性，較羅氏培養(yǎng)陽性率提高，且培養(yǎng)時間縮短，但對生物安全級別要求高，在基層難以開展［11］。而Xpert MTB/RIF方法整個流程僅需2 h，手工只需處理樣本即上機自動檢測。本文研究結(jié)果表明Xpert MTB/RIF檢測具有同液體培養(yǎng)及藥敏試驗接近的臨床應(yīng)用價值，提示可以用Xpert MTB/RIF 對疑似耐藥結(jié)核進行初篩［12］。

除了痰標本外，Xpert MTB/RIF 還可以檢測灌洗液、胸腹水、引流液、腦脊液標本，據(jù)研究報道，陽性率依次為灌洗液65.9%、痰樣本53.9%、胸水16.4%，特異性均較高［13］。Xpert MTB/RIF 檢出rpoB 陽性基因型耐藥高于藥敏試驗表型耐藥結(jié)果，大多數(shù)原因是標本中存在異質(zhì)性利福平耐藥，與某些基因位點突變的低水平耐藥相關(guān)，也可能存在Xpert MTB/RIF 檢測的假耐藥，可能與沉默子突變或Xpert MTB/RIF 檢測系統(tǒng)判讀錯誤有關(guān)，對不一致菌株應(yīng)進行rpoB 耐藥基因核心區(qū)間測序［14］。另外，Xpert MTB/RIF 系統(tǒng)不能區(qū)分是否活性結(jié)核分枝桿菌，不能被用于監(jiān)測治療或復發(fā)［15］。綜上，Xpert MTB/RIF 是一種結(jié)核病快速診斷的新方法，具有快速、簡便、準確、對生物安全要求不高等特點，可以在基層開展，能同時檢測出結(jié)核分枝桿菌及是否對利福平耐藥，對肺結(jié)核及肺外結(jié)核病的早期診斷具有重要意義，是痰涂片鏡檢及培養(yǎng)檢查方法的有力補充。