耿妍 魯曉嵐 耿燕 史海濤

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確肝損傷因素外所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征［1］。隨著“全球肥胖”的流行，NAFLD 在中國(guó)及歐美發(fā)達(dá)國(guó)家的患病率逐年升高，該病目前已被公認(rèn)為是成人及兒童慢性肝臟疾病的首要病因［2］。NAFLD 作為一種復(fù)雜的疾病，病理生理機(jī)制尚未完全闡明，其發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素包括肥胖、胰島素抵抗、2 型糖尿病、高脂血癥等［3］。因此，探究單純性肥胖引起NAFLD 的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于了解從單純性肥胖（Simple Obesity，SO）進(jìn)展為NAFLD 這一過(guò)程至關(guān)重要。近年來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群作為一個(gè)新的環(huán)境因素在肥胖和NAFLD 的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［4-5］。目前腸道菌群在肥胖轉(zhuǎn)化為NAFLD 的作用及機(jī)制研究較少，本研究將探討腸道菌群在肥胖及NAFLD的作用，以期為肥胖及NAFLD 的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD 雄性大鼠［動(dòng)物合格證號(hào)：skxk（shaan）2018-001］購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京金山川科技發(fā)展有限公司。糞便總DNA 提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊試劑有限公司。實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司。ELISA 試劑盒購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本OLYMPUS 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡雄性SD 大鼠30 只（SPF 級(jí)），平均體重160 g 左右，分籠飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件符合二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)）。高脂飼料配方：10%豬油、2%膽固醇、5%蔗糖、0.5%豬膽鹽、82.5%基礎(chǔ)飼料；普通飼料購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

將30 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（NC 組）（普通飼料，n=6）、模型組（高脂飼料，n=24）。分別給予普通飼料及高脂飼料喂養(yǎng)8 周。于8 周末處死所有大鼠，行肝臟蘇木精伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色，光鏡下觀察篩選模型組中發(fā)生脂肪變的為NAFLD 組（n=12），未發(fā)生脂肪變的為SO 組（n=12）。

1.3.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清：膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）。

1.3.3 動(dòng)態(tài)比濁法測(cè)定血清內(nèi)毒素

按照內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.4 肝臟組織及回腸粘膜HE 染色

分別取各組大鼠肝臟及回腸組織（距回盲瓣7～17 cm），置于4%的多聚甲醛溶液中，常規(guī)制成石蠟切片，行HE 染色。

1.3.5 腸道糞便中乳酸桿菌屬、大腸桿菌屬、雙歧桿菌屬的測(cè)定

嚴(yán)格按照北京艾德萊試劑糞便總DNA 提取試劑盒及日本TaKaRa 公司熒光實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)試劑盒操作。以DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增大腸桿菌屬，乳酸桿菌屬，雙歧桿菌屬，標(biāo)準(zhǔn)品為內(nèi)參。引物見(jiàn)表1［6］。

表1 相關(guān)引物信息Table 1 Related primer information

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者兩組間比較采用LDL-t檢驗(yàn)。糞便細(xì)菌定量結(jié)果數(shù)據(jù)以logx±s表示。采用Pearson相關(guān)分析和Spearman 秩相關(guān)分析自變量和因變量之間的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況、體重及飲食變化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠均無(wú)死亡。喂養(yǎng)至第8周時(shí)，NC 組大鼠皮毛光澤，反應(yīng)靈敏。SO 組及NAFLD 組大鼠皮毛暗淡無(wú)光澤，活動(dòng)減少，精神萎靡，進(jìn)食量較多。喂養(yǎng)至第4、8 周時(shí)模型組大鼠體重明顯高于NC 組大鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而SO 組與NAFLD 組體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 肝臟病理變化

光鏡下可見(jiàn)NC 組大鼠肝細(xì)胞呈條索狀排列，圍繞中央靜脈呈放射狀，核圓、大、居中。SO 組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)脂滴及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。NAFLD 組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，可見(jiàn)散在小泡性脂滴浸潤(rùn)，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞及壞死。見(jiàn)圖1。

表2 各組大鼠體重變化（±s，g）Table 2 Weight change in each group（±s，g）

表2 各組大鼠體重變化（±s，g）Table 2 Weight change in each group（±s，g）

注：與NC 組比較，aP＜0.05。

分組NC 組SO 組NAFLD 組F 值P 值0 w 體重241.75±11.56 246.90±12.30 245.51±13.54 44.352 0.912 2 w 體重345.25±12.84 387.95±22.32 397.83±16.92 46.368 0.819 4 w 體重392.25±16.93 454.95±24.84a 463.21±11.85a 48.305 0.033 8 w 體重451.75±13.25 508.77±26.29a 514.75±16.23a 50.023 0.025

圖1 各組大鼠肝臟病理改變（HE，×400）Figure 1 Pathological changes of liver of rats in each group（HE，×400）

2.3 各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、內(nèi)毒素、血脂比較

SO 組及NAFLD 組大鼠血清ET、TG 水平顯著高于NC 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SO組TC 水平顯著高于NC 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。NAFLD 組ET 水平顯著高于SO 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3 組間ALT、AST 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。NAFLD 組與余兩組TC 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），NAFLD 與SO 組TG 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 各組大鼠腸道菌群的變化

模型組腸道糞便大腸桿菌屬數(shù)量顯著高于NC 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。NAFLD 組大腸桿菌屬數(shù)量顯著高于SO 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬數(shù)量顯著低于NC 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。NAFLD 組雙歧桿菌屬數(shù)量顯著低于SO組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SO 組與NAFLD 組乳酸桿菌數(shù)量相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 腸道病理改變

光鏡下可見(jiàn)NC 組小腸粘膜表面微絨毛排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰。SO 組小腸上皮細(xì)胞腫脹，細(xì)胞游離面微絨毛短小，排列紊亂，黏膜層可見(jiàn)少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴灶性糜爛。NAFLD 組小腸粘膜上皮細(xì)胞腫脹，結(jié)構(gòu)明顯紊亂，細(xì)胞游離面微絨毛短小，黏膜層可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴灶性糜爛。見(jiàn)圖2。

表3 三組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、內(nèi)毒素、血脂的比較（±s）Table 3 Comparison of serum transaminase and endotoxin of 3 group（±s）

表3 三組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、內(nèi)毒素、血脂的比較（±s）Table 3 Comparison of serum transaminase and endotoxin of 3 group（±s）

注：與NC 組比較，aP＜0.05，與SO 組比較，bP＜0.05。

分組NC 組SO 組NAFLD F 值P 值A(chǔ)LT（IU/L）48.50±12.39 48.33±13.45 50.58±12.63 1.012 1.351 AST（IU/L）146.67±16.77 154.67±12.37 156.75±13.19 0.534 1.026 ET（pg/mL）4.21±1.80 10.95±4.79a 15.43±4.64ab 26.321 0.001 TC 1.44±0.45 2.07±0.48a 1.85±0.44 0.931 0.005 TG 1.14±0.54 2.04±0.33a 2.34±0.49a 1.021 0.002

表4 各組大鼠腸道菌群結(jié)果比較（±s）Table 4 The results of intestinal flora in rats were compared（±s）

表4 各組大鼠腸道菌群結(jié)果比較（±s）Table 4 The results of intestinal flora in rats were compared（±s）

注：與NC 組比較，aP＜0.05，與SO 組比較，bP＜0.05。

分組NC 組SO 組NAFLD 組F 值P 值大腸桿菌屬8.41±0.96 8.99±0.49a 9.54±0.69ab 15.362 0.000雙歧桿菌屬9.23±0.65 8.65±0.33a 8.36±0.57ab 19.821 0.000乳酸桿菌屬8.38±0.72 7.76±0.47a 7.33±0.49a 18.365 0.021

圖2 各組大鼠小腸粘膜病理改變（HE，×400）Figure 2 Pathological changes of small intestinal mucosa of rats in each group（HE，×400）

2.6 腸道菌群與內(nèi)毒素、轉(zhuǎn)氨酶的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析及Spearman 秩相關(guān)分析表明，大腸桿菌與ET、肝臟脂肪變程度均呈正相關(guān)（P＜0.05），乳酸桿菌、雙歧桿菌與ET、肝臟脂肪變均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

3 討論

肥胖是導(dǎo)致NAFLD 的重要危險(xiǎn)因素，有研究表明在重度肥胖人群中NAFLD 的發(fā)病率可達(dá)90%［7］。從肥胖到NAFLD 的發(fā)生發(fā)展有多種機(jī)制參與，其中腸道菌群的構(gòu)成紊亂可能是重要的組成部分。本研究通過(guò)高脂飲食的飼養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠肥胖模型，觀察到高脂飲食可以誘發(fā)大鼠腸道菌群紊亂以及NAFLD 的出現(xiàn)。

陳杏云等［8］通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠8 周后，發(fā)現(xiàn)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。分析高脂飲食對(duì)于腸道菌群構(gòu)成影響的機(jī)制，已有的研究結(jié)果表明，高脂飼料可以使腸道中作為菌群養(yǎng)料來(lái)源的碳水化合物的生成減少，同時(shí)高脂飲食代謝的部分產(chǎn)物可以破壞腸道菌群所在的微環(huán)境，從而影響腸道菌群的組成平衡，導(dǎo)致機(jī)體腸道菌群的紊亂［9］。

腸道菌群可以通過(guò)多種機(jī)制影響肥胖。首先，腸道菌群可以影響機(jī)體的能量平衡。B?ckhed等［10］的研究發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠的腸道菌群酵解碳水化合物的能力增強(qiáng)，因此為宿主提供的能量增多，促進(jìn)肥胖。其次，腸道菌群失調(diào)可破壞腸道上皮屏障，增加腸道的通透性，使得血清內(nèi)毒素含量增多，這種腸源性內(nèi)毒素水平的升高可以導(dǎo)致慢性炎癥的形成，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖［11］。

腸道菌群紊亂既可以通過(guò)促進(jìn)肥胖間接地影響NAFLD，也可以通過(guò)多種通路直接促進(jìn)NAFLD。例如，針對(duì)NAFLD 的研究表明腸道菌群通過(guò)改變腸道對(duì)膽堿和膽汁酸的代謝，產(chǎn)生丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸及禁食誘導(dǎo)脂肪因子等，從而影響NAFLD 的發(fā)?。?2］。另一方面，前述的血清內(nèi)毒素可經(jīng)由門靜脈進(jìn)入肝臟，誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6 等炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)NAFLD 的發(fā)?。?3-14］。本研究發(fā)現(xiàn)NC 組到SO 組，再到NAFLD 組，大腸桿菌屬計(jì)數(shù)顯著增加，而優(yōu)勢(shì)菌顯著減少，腸道粘膜結(jié)構(gòu)由輕到重均有破壞，腸源性內(nèi)毒素水平逐漸增高，這與之前研究是一致的［15］。行相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠腸道菌群失調(diào)與內(nèi)毒素及脂肪肝病變程度呈正相關(guān)。研究結(jié)果提示腸道菌群紊亂在脂肪蓄積及從SO 向NAFLD 進(jìn)展過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。

從治療的角度來(lái)說(shuō)，有研究顯示雙歧桿菌可改善腸道屏障功能并降低血清內(nèi)毒素水平，從而減緩NAFLD 的進(jìn)展［16］。另外，對(duì)肥胖患者采取飲食干預(yù)能夠使產(chǎn)生內(nèi)毒素的腸道菌種類比例明顯下降［17］。

表5 腸道菌群與內(nèi)毒素、肝脂肪變程度的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of intestinal flora with endotoxin and liver fat change

綜上所述，腸道菌群可通過(guò)多種途徑和機(jī)制影響NAFLD 的發(fā)病。通過(guò)優(yōu)化腸道菌群構(gòu)成，針對(duì)NAFLD 的靶向治療在動(dòng)物模型中獲得一定療效，但迄今為止相關(guān)的臨床研究不足。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)步，調(diào)節(jié)腸道菌群或可成為治療NAFLD的新方式。