王金玲 鄭秉武 曹 霞 楊龍峰 葛金英 盧愛桃

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特，010010；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，呼和浩特，010010；3.呼和浩特市園林管理局動物園管理處，呼和浩特，010050；4.北京市延慶區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，北京，102100；5.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，哈爾濱，150001；6.內(nèi)蒙古自治區(qū)綜合疾病預(yù)防控制中心，呼和浩特，010031)

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)引起的一種以致死性腦炎為特征的人畜共患傳染病[1-3]。RABV宿主范圍廣，可感染人(Homosapiens)、鼠(Rattus)、家兔(Oryctolaguscuniculusdomesticus)、豚鼠(Caviaporcellus)、馬(Equuscaballus)、牛(Bos)、羊(Caprinae)、犬(Canis)、貓(Felidae)等所有溫血動物，其死亡率接近100%[4]。RABV為彈狀病毒科(Rhaboviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)成員，其基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA[5]。目前，世界衛(wèi)生組織已將RABV分為7種基因型，基因Ⅰ型、基因Ⅱ型(Lagos蝙蝠株)、基因Ⅲ型(Mokola病毒原型株)、基因Ⅳ型(Duvenhage原型株)、基因Ⅴ型(EBLV1)、基因Ⅵ型(EBLV2)[1]和基因Ⅶ型(ABLV)[6]。目前，中國RABV分離株來源于6個進(jìn)化分支，ChinaⅠ、ChinaⅡ、ChinaⅤ、ChinaⅥ屬于Asian譜系，China Ⅲ屬于Cosmopolitan 譜系，China IV屬于Arctic-like譜系[7]。Feng 等[8]2015年在新疆和內(nèi)蒙地區(qū)首次分離到屬于草原型進(jìn)化分支的RABV分離株，該分支屬于Cosmopolitan譜系。

RABV的核蛋白(NP)基因相對恒定，在不同病毒株之間高度保守，而且與病毒的型別有關(guān)，可以作為群變異的指標(biāo)，用于RABV感染的診斷、基因分型和進(jìn)化研究[9]。本研究對3只患狂犬病死亡的美洲駝(Lamaglama)的小腦組織樣本進(jìn)行RABVN基因擴(kuò)增、測序和遺傳進(jìn)化分析，闡明其遺傳進(jìn)化規(guī)律，為狂犬病的防控提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 腦組織樣品

3只已被確診和報道的患狂犬病死亡美洲駝[10]的小腦組織，樣品信息見表1。

表1 腦組織樣品信息Tab.1 Background information of brain specimens

1.2 引物及主要試劑

RABVN基因特異性引物：上游引物(Nf2)5′-GTCAATAATCAGGTGGTC-3′，下游引物(Nr2)5′-AGCCTAGTGAACGGAAGTG-3′，PCR 產(chǎn)物長度為834 bp[11]。TRIzol Reagent RNA 提取試劑盒和隨機(jī)引物購自Invitrogen 公司，DNA marker和ExTaqDNA 聚合酶購于寶生物工程(大連)有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 RNA提取和N基因擴(kuò)增

按TRIzol Reagent RNA提取試劑盒使用說明書提取3只美洲駝小腦組織總RNA，以隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，按PCR試劑盒說明書進(jìn)行N基因擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR結(jié)果。

1.4 基因測序和遺傳進(jìn)化分析

獲得的3個樣品PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因測序。測序所得的3個基因片段用DNAStar(Version 5.01，Lasergene，USA)生物分析軟件中的MegAlign進(jìn)行序列分析和比對，用Mega生物分析軟件的Maximum Likelihood method繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，分析3株RABVN基因遺傳進(jìn)化規(guī)律。代表性參考毒株序列從GenBank 檢索獲得。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果

經(jīng)基因擴(kuò)增獲得3個大小均為850 bp左右的目的條帶。

2.2 RABV N基因遺傳進(jìn)化分析

同源性分析表明，這3株病毒間的N基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均為100%。進(jìn)化分析表明，3株病毒株基因序列與2011年呼和浩特奶牛源毒株(cow 96 Hohhot)、2011年呼和浩特犬源毒株(dog 92 Hohhot)、2013年內(nèi)蒙古牛源毒株(KC465376)、2007年湖北犬源毒株(EU159381)，2016年北京犬源毒株(KY214287)、2018年北京犬源毒株(MK514271)、2006年天津犬源毒株(KT221104)、2009年福建犬源毒株(FJ866827)、2007年河北Homosapiens源毒株(EU267777)和2009年北京Homosapiens源毒株(EU700031)的基因同源率均為100%，位于同一個分支內(nèi)，均屬于Asian譜系。

3 討論

自2009年以來，內(nèi)蒙古地區(qū)動物狂犬病一直發(fā)生，特別是2011—2014年疾病呈多發(fā)態(tài)勢[10-12]。2015年王金玲等[12]報道了2011年流行的2株呼和浩特地區(qū)奶牛源和犬源RABVN基因核苷酸序列都屬于 Asian 譜系，都與參考的河北(EU267777、EU549783)、山西(GU591790)和北京(EU700031)分離株具有最高的親緣關(guān)系，同源率在99.3%—99.6%，說明這2株病毒的N基因與山西、北京等毒株起源于共同的祖先。2016年周微微等[11]報道了2009—2012年內(nèi)蒙古地區(qū)16株RABVN基因遺傳進(jìn)化分析顯示12株毒株屬于CTN-1(Asian譜系)，4株毒株屬于ERA(Cosmopolitan譜系)。2020年曹霞等[10]報道了2015年確診的呼和浩特地區(qū)3例美洲駝狂犬病自然病例。

人和動物狂犬病絕大多數(shù)都是由犬咬傷引起[13]。據(jù)現(xiàn)場調(diào)查，流浪犬易于進(jìn)入發(fā)病的動物園內(nèi)，因此，可以推測最早感染RABV的NM11465號美洲駝的發(fā)病與狂犬病帶毒犬的咬傷有關(guān)。被NM11465號美洲駝在發(fā)病過程中咬傷的NM11478號和NM11587號美洲駝分別于被咬傷后17 d和29 d發(fā)病死亡[10]。本研究的3株美洲駝源RABVs之間N基因核苷酸和氨基酸序列的同源性均為100%，均位于同一個進(jìn)化分支，都屬于 Asian 譜系，說明這3個毒株N基因未發(fā)生同義突變[14]。3株美洲駝源RABVN基因核苷酸序列均與2011年呼和浩特奶牛源毒株(cow 96 Hohhot)、2011年呼和浩特犬源毒株(dog 92 Hohhot)、2013年內(nèi)蒙古牛源毒株(KC465376)、2007年湖北犬源毒株(EU159381)、2016年北京犬源毒株(KY214287)、2018年北京犬源毒株(MK514271)、2006年天津犬源毒株(KT221104)、2009年福建犬源毒株(FJ866827)、2007年河北Homosapiens源毒株(EU267777)和2009年北京Homosapiens源毒株(EU700031)的基因親緣關(guān)系最近，基因序列同源率為100%，均位于Asian譜系。說明這些地區(qū)流行的參考毒株起源于同一祖先，且在內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)一直存在。