吳亞江 王 晨 翟俊瓊 陳 武

(廣州動物園，廣州市野生動物研究中心，廣州，510070)

雙垂鶴鴕(Casuariuscasuarius)俗稱食火雞，屬于平胸總目(Ratitae)，鶴鴕目(Struthioniformes)，鶴鴕科(Casuariidae)鳥類，分布于新幾內(nèi)亞南部及澳大利亞北部的熱帶雨林中，善于奔跑跳躍，性情機敏兇猛，主要以果實為食，偶爾捕捉一些蝸牛、昆蟲、小魚、鳥及鼠類。圈養(yǎng)條件下，處于幼雛至亞成體時期的鶴鴕，雌雄個體之間的體型外貌差別不大，性別鑒別存在極大的困難。需要確定其性別時，必須在保定狀態(tài)下翻查泄殖腔進行形態(tài)學鑒定，否則從外觀來分辨鶴鴕幼雛甚至成年個體的性別是難以確定的，但鶴駝的保定是極為危險，這種操作不僅對飼養(yǎng)人員和動物造成極大的安全隱患，也對鶴鴕的飼養(yǎng)、配對和繁育造成了極大的困難。所以，需要建立一種簡便、準確、非損傷性的鶴鴕性別鑒定方法。

當前國內(nèi)圈養(yǎng)條件下的鶴鴕數(shù)量較少，能夠成功繁殖的個體也是屈指可數(shù)[1-3]，主要原因是圈養(yǎng)鶴鴕性情比較兇猛，發(fā)情期同性之間易出現(xiàn)打斗，雌雄找不到合適的配對對象，造成雌雌、雄雄配對的現(xiàn)象。在不確定性別配對是否合適的情況下，繁殖期的營養(yǎng)管理與群體管理就無從談起，導(dǎo)致鶴鴕即使能夠順利產(chǎn)卵，也會出現(xiàn)受精卵較少、質(zhì)量差、健雛率低的情況，造成人員物質(zhì)等方面很大的浪費。如果能有一種從幼雛就能鑒定其性別的方法，我們可以進行標記，提早做好配對工作，減少發(fā)情期的打斗，提高配對種鳥的量，從而提高鶴鴕的繁殖率。

鳥類的性別按照染色體的不同，雌性個體的基因型為ZW，雄性的是ZZ。目前，常用EE0.6(0.6-Eco R I-fragment)和CHD(chromo-helicase-DNA-binding gene)性別連鎖基因鑒定鳥類的性別[4-7]。孫志明等[8]對白枕鶴(Grusvipio)和丹頂鶴(Grusjaponensis)CHD基因和EE0.6基因的序列進行了特異性擴增，成功地對鶴類的性別進行了鑒定。Griffiths等[5]利用CHD基因?qū)饎傷W鵡Psittacdae等28種非平胸鳥類進行了性別鑒定，但這種方法并不適合平胸鳥類性別鑒定。2010年付晶等[9-10]利用已報道的大量通用引物，進行18種組合，最終找到了1對驗證引物和1對有效引物，成功鑒定了鴯鹋(Dromaiusnovaehollandiae)和鴕鳥(Struthiocamelus)的性別。2015年，Morinha等[11]使用高分辨率溶解曲線的方法和測序的方法，對鴕鳥、美洲鴕(Rheaamericana)、鴯鹋和南方食火雞的4個性別鑒定候選基因(NTRK2、RASEF、TMEM2、DAPK1)進行溶解曲線分析，詳細的解釋了這4個基因在4種鳥類上SNP位點的不同。但這一實驗方法僅是理論上說明這種方法的可行性，并沒有建立具體的鑒定方法，且該實驗條件要求較高、操作復(fù)雜，成本高，實用性低等，不能夠推廣使用，存在極大的局限性。

因此，迫切需要開發(fā)一種簡單方便的鶴鴕性別鑒定方法，本研究基于RASEF基因的測序與分析，通過SNP位點對鶴鴕進行性別鑒定，建立一種鑒定鶴鴕性別的快速、準確、可靠和安全的分子生物學方法，為鶴鴕的飼養(yǎng)管理與繁殖提供便利。

1 研究材料

本試驗共采集14只雙垂鶴鴕樣本，其中2019年從廣東多家動物園采集6只雙垂鶴鴕的樣本，包括3只已知性別(2只雄鳥和1只雌鳥)和3只未知性別的個體，樣本均為羽毛。另外8只未知性別的個體作為驗證樣本來自華東某動物園，其中4份羽毛，4份血液樣品。11只未知性別鶴駝樣品，根據(jù)飼養(yǎng)繁殖記錄和形態(tài)學觀察，性別為雌性個體8只，雄性為3只。

2 研究方法

2.1 基因組DNA提取

使用Blood Tissue DNA Kit(Omega Bio-Tek公司)和Forensic Tissue DNA Kit(Omega Bio-Tek公司)試劑盒分別對血液和羽毛樣品進行DNA的提取。將羽毛的基部剪碎或取10 μL血液放入1.5 mL Eppendorf 離心管中，按照試劑盒的提取方法和步驟完成基因組DNA的提取。取適量的總DNA，使用7415 Nano超微量分光光度計檢測基因組DNA的純度和濃度，將基因組DNA保存在-20℃冰箱，備用。

2.2 傳統(tǒng)方法實驗測試

2.2.1 引物設(shè)計

文獻[8-9]中選取已報道的4對(EE0.6/1272、P9/P14、P2/P8和2550F/2718)鳥類性別鑒定的通用引物(表1)。其中EE0.6/1272作為驗證引物，對鶴鴕性別進行鑒定；P2/P8、P9/P14和2550F/2718是有效引物，檢測提取的鶴駝DNA是否為有效DNA。

2.2.2 PCR擴增與檢測

以羽毛和血液中提取的DNA為模板，以EE0.6/1272、P9/P14和2550F/2718R為引物進行PCR反應(yīng)，擴增反應(yīng)在BIO-RAD T100TMPCR 儀上進行。引物PCR擴增體系：擴增總體積為50 μL，其中Premix ExTaq20 μL、ddH2O 15 μL、RASEF-F1 5 μL、RASEF-R1 5 μL 、DNA模板5 μL。陰性對照中加5 μL的ddH2O，其余試劑不變。

EE0.6/1272、 P2/P8、2550F/2718R反應(yīng)程序及條件均按照文獻中為標準。

P9/P14反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s；47.0℃ 40 s；72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃，10 min。

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用紫外線投射分析儀凝膠成像系統(tǒng)檢測擴增結(jié)果。

2.3 新方法實驗設(shè)計與驗證

2.3.1 引物設(shè)計

選取文獻中最新的研究報道中RASEF基因作為靶基因[11]，將用文獻中雙垂鶴鴕的序列，在NCBI中BLAST，得到平胸目鳥類鴕鳥南非亞種(Struthiocamelusaustralis)和褐幾維鳥北島亞種(Apteryxaustralismantelli)的基因組組裝的同源序列(NCBI登錄號：JJRT01061438.1和LK107340.1)。通過同源序列的保守區(qū)域進行引物設(shè)計，設(shè)計的引物見表1。

表1 RASEF基因引物序列Tab.1 Primer sequence of RASEF gene

2.3.2 目的基因 PCR擴增

設(shè)計的引物反應(yīng)體系和條件如下：擴增反應(yīng)在BIO-RAD T100TMPCR 儀上進行。引物PCR擴增體系：擴增總體積為50 μL，其中Premix ExTaq20 μL、ddH2O 15 μL、上下游引物(10 pmol/L)各5 μL、DNA模板5 μL。陰性對照中加5 μL的ddH2O，其余試劑不變。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；49℃退火1 min；72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。利用1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，然后送至睿博興科生物技術(shù)有限公司進行測序。

2.3.3 退火溫度優(yōu)化實驗

以上述提取的DNA為模板進行PCR，設(shè)退火溫度分別為49.0℃、47.0℃、46.0℃、45.0℃，其他條件及體系維持不變，擴增后利用1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，確定最佳退火溫度。

2.3.4 靈敏性測試

用7415 Nano超微量分光光度計分別檢測羽毛和血液提取的基因組DNA的濃度，血液DNA的初始濃度在80—100 ng/μL，羽毛DNA的初始濃度在15—20 ng/μL，對80 ng/μL的樣品以0、5、25、125倍分別稀釋到80 ng/μL、3.2 ng/μL、0.64 ng/μL，并以各自濃度為模板進行PCR，擴增后利用1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，觀察測試結(jié)果。

2.3.5 序列處理

3730xl(ABI)測序儀雙向測序，利用DNAStar v 7.1.0軟件包(DNASTARlnc，Madison，WI，USA)中的Seqman程序?qū)y序結(jié)果進行正反鏈手工校正，所有的核苷酸位點均無雜峰。在序列中，如果存在明顯由于測序問題造成的堿基錯誤，為確保結(jié)果的準確性需重新對其測定。序列經(jīng)過校對無誤后，利用SeqMan中的“存成一致序列(save consensus)”選項中“Single file”命令，根據(jù)樣品信息重新命名，將正反鏈存成fas，aqd和seq 3種形式的文件，完成序列的拼接和手工校對。最后，比對分析序列中的SNP位點。

3 結(jié)果分析

1對驗證引物(EE0.6/1272)和3對有效引物(P2/P8、P9/P14和2550F/2718)對已知性別中的雌雄2只鶴鴕進行PCR檢測，瓊脂糖凝膠結(jié)果表明：3對驗證引物中，P9/P14出現(xiàn)條帶，P2/P8和2550F/2718均無條帶(圖1)，1對有效引物雌雄都出現(xiàn)多條電泳條帶(圖2)。實驗結(jié)果說明，利用1對驗證引物和1對有效引物性別檢測的方法無法鑒定鶴鴕的性別。

我們使用本實驗新設(shè)計的引物檢測14只鶴鴕，PCR擴增后用瓊脂糖凝膠電泳(圖3)。結(jié)果顯示，此引物通過PCR成功擴增14只鶴鴕的樣本，擴增條帶單一，條帶大小符合預(yù)期，約為300 bp(圖3)。退火溫度測試顯示，在45—49℃均能擴增出目的大小條帶，而在退火溫度為49.0℃擴增條帶最明亮；濃度為 80 ng/μL 的DNA為模板，以5倍依次稀釋，PCR均出現(xiàn)目的條帶(圖5)，稀釋0倍時條帶最亮，亮度隨著濃度降低而減弱。

對鶴鴕的PCR產(chǎn)物進行雙向測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用反向引物RASEF-R1的測序結(jié)果由于存在插入缺失而出現(xiàn)大量雙峰，而使用正向引物RASEF-F1的測序結(jié)果序列峰值較好，可以作為后期分析資料。通過比較采自廣東某些動物園的3只已知性別個體的序列，發(fā)現(xiàn)雄性個體在擴增RASEF基因序列的第119位點、157位點和162位點分別為G/G、T/T、C/C，而雌性個體在這3個位點均為雜合子A/G、T/G、C/T。由于鳥類的雄性染色體是ZZ，雌性染色體為ZW，所以雄性個體在這3個位點呈現(xiàn)單一的堿基峰值，而雌性個體的這3個位點的堿基為雜合子，測序結(jié)果在該位點中出現(xiàn)雙峰(圖6)。

我們對驗證組中未知性別的11只鶴鴕樣本進行鑒定，根據(jù)測序結(jié)果判定為2只雄性和9只雌性，結(jié)果與動物園后續(xù)提供的形態(tài)學鑒定信息相一致。因此，我們的實驗結(jié)果可以準確地對未知性別的鶴鴕樣品進行性別鑒定。

4 討論

目前，從外觀無法鑒定性別的鳥類，通常采用分子生物學的方法篩選性染色體基因組上的非同源區(qū)域，然后進行PCR特異性擴增，用瓊脂糖凝膠檢測條帶的方法來鑒定鳥類的性別，電泳結(jié)果呈現(xiàn)2條帶的為雌性，1條帶的是雄性，或者電泳結(jié)果呈現(xiàn)1條帶的為雌性，無條帶的是雄性。鸚鵡(Psittaculaspp.)、丹頂鶴與雀類等鳥類的性別鑒定方法都是基于EE0.6和CHD基因的同源性序列來開發(fā)的。

迄今為止，關(guān)于鶴鴕的非保定狀態(tài)下簡易可靠的性別鑒定方法極少。因此，建立一種簡單、便捷、無損且對鶴鴕傷害較小的性別鑒定方法非常迫切。本研究中，由于RASEF基因短小，存在連鎖變異位點，測序簡單，我們把RASEF基因作為靶向基因，選取其他平胸總目鳥類的RASEF基因的同源序列設(shè)計引物，進行PCR及測序。RASEF基因序列顯示，雄性所有位點的堿基均為單一峰值；雌性個體中，有3個位點(119、157和162)均為雜合子(圖5)，利用該基因在性染色體中SNP位點上的差異檢測個體的性別。我們對14只采自不同動物園的鶴鳥羽毛或組織利用該方法進行鑒定，其結(jié)果與后續(xù)形態(tài)學分析一致，說明該方法結(jié)果可靠。同時，做最適退火溫度試驗時，發(fā)現(xiàn)各退火溫度均能擴增出目的條帶，說明該引物對退火溫度要求不高，適用的溫度范圍較廣；敏感性試驗結(jié)果顯示4種不同濃度均能有效擴增出目的條帶，也表明該引物敏感性高，對試驗樣品采集的量要求不高。

本研究打破傳統(tǒng)利用PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR條帶數(shù)量來確定性的實驗方法，利用正向測序的SNP位點變化情況來確定鶴鴕的性別，鑒定結(jié)果與付晶等[9-10]實驗方法相比，無雜帶、錯峰等現(xiàn)象，鑒定結(jié)果更可靠。基于RASEF對鶴鴕進行性別鑒定的方法，具有成本小、不用捕捉動物、靈敏度較高，僅需采集少量羽毛、對動物沒有任何損傷、鑒定快速等優(yōu)點，檢測的準確率極高，是一種較理想的鶴鴕性別鑒定方法。未來可以在此基礎(chǔ)上進一步開發(fā)熒光定量PCR的檢測方法，減少測序的過程，可以獲得更簡便快捷的效果，為以后平胸鳥類性別鑒定的研究提供了新的技術(shù)方法和研究方向。