閻朝華 胡安東 陳國權 周碧君，3*文 明，3* 王開功，3 趙大杰 張 旭

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽，550025；2.貴州大學動物疫病研究所，貴陽，550025；3.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴陽，550025)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種重要人畜共患病的條件性致病菌，根據(jù)其寄生場所將其分為腸內(nèi)致病性大腸桿菌(enteropathogenicEscherichiacoli，EnPEC)和外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenicEscherichiacoli，ExPEC)。根據(jù)產(chǎn)毒素的不同可將致病性大腸桿菌分為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(entero toxigenicEscherichiacoli，ETEC)、產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌(shigalike toxinEscherichiacoli，SLTEC)、 腸道致病性大腸桿菌(enteropathogenicEscherichiacoli，EPEC)、敗血性大腸桿菌(septicEscherichiacoli，SepEC)及尿道致病性大腸桿菌(urethral pathogenicEscherichiacoli，UPEC)，在動物群體中最常見的為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌[1-3]。棒狀桿菌(Corynebacterium)屬于棒狀桿菌屬，是一類革蘭氏陽性類球狀或棒狀菌，表面無鞭毛，不形成芽孢，多呈叢、柵欄樣或單個無規(guī)則排列的兼性厭氧菌[4]。感染機體后臨床表現(xiàn)以多種組織和器官發(fā)生化膿性或干酪樣病變?yōu)橹饕卣鱗5-6]。綠色氣球菌(Aerococcusviridans)屬鏈球菌科(Streptococcaceae)氣球菌屬，1953年由Williams等[7]首次提出并命名。1965年Whittenbury在對一些片球菌(Pediococcus)和綠色氣球菌、腸球菌(Enterococcus)的親緣性對比后發(fā)現(xiàn)可以根據(jù)表型特征將氣球菌(Aerococcus)與片球菌區(qū)分，同時將綠球菌(Aerococcusviridans)、蝦片球菌(Pediococcushomari)和綠色氣球菌統(tǒng)一稱為綠色氣球菌[8]。綠色氣球菌可從空氣、水、土壤等自然環(huán)境中廣泛分離得到[9]。動物和人感染后患心內(nèi)膜炎、菌血癥、敗血癥、敗血型關節(jié)炎、尿道感染、腦膜炎、膿毒性關節(jié)炎等疾病[7-10]。

2019年冬季貴州某竹鼠養(yǎng)殖場養(yǎng)殖中華竹鼠(Rhizomyssinensis)近20只發(fā)病，發(fā)病初期表現(xiàn)進食減少，精神萎靡，一周后出現(xiàn)下牙脫落，肛門有黏稠膿性分泌物流出，對養(yǎng)殖企業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。查閱相關文獻并設計竹鼠圓環(huán)病毒、竹鼠細小病毒、新型竹鼠源阿卡斑病毒等病毒的特異性引物對其送檢病料組織進行PCR快速檢測，PCR檢測結(jié)果為陰性；對送檢病料體內(nèi)病原菌進行分離培養(yǎng)并采用形態(tài)學觀察、生化試驗鑒定和16S rDNA基因序列分析，對其分離菌株進行鑒定并結(jié)合動物回歸實驗結(jié)果顯示從送檢竹鼠內(nèi)臟組織分離出竹鼠源致病性大腸桿菌、致病性棒狀桿菌和致病性綠色氣球菌3種病原菌，綜上推斷該養(yǎng)殖場竹鼠死亡原因是竹鼠混合3種致病性細菌所造成。筆者對混合感染竹鼠源致病性大腸桿菌、致病性棒狀桿菌和致病性綠色氣球菌的3只竹鼠病變組織進行組織病理學分析，以健康正常內(nèi)臟組織器官病理切片作為對照，以期為竹鼠源致病性大腸桿菌、致病性棒狀桿菌和致病性綠色氣球菌混合感染引起的組織病理學相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料來源

貴州某竹鼠養(yǎng)殖場送檢3只體重均為1 kg患病竹鼠，1只體重為800 g的健康竹鼠購自貴州康源生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑

蘇木精染液(140401)、伊紅染液(140401)、乙醇(70%、80%、95%、100%)、二甲苯、通用型組織固定液、石蠟等均由武漢塞維爾生物科技有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 送檢病料的剖檢

在無菌操作臺對送檢3只竹鼠進行編號，分別為S1、S2、S3。剖檢觀察并記錄其組織病變特征。

1.2.2 組織病理學觀察

取正常健康竹鼠做對照，3只送檢竹鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟，通用型組織固定液固定組織樣品，樣品經(jīng)過石蠟包埋切片，蘇木素—伊紅(H.E)染色，對用其病理變化3D全景掃描文件觀察并描述(掃描儀型號：3D HISTECH Pannoramic250，made in Hungary)。以1只健康竹鼠內(nèi)臟組織切片為對照，對3只送檢患病竹鼠內(nèi)臟組織切片進行對比分析，探究竹鼠混合感染3種致病性細菌的病理學變化。

2 實驗結(jié)果

2.1 剖檢結(jié)果

正常健康竹鼠體型豐滿、毛色光亮(圖1-1)，剖檢后可以看到心臟血管血液充盈、顏色鮮紅、無出血、淤血現(xiàn)象(圖1-2)；肝臟顏色鮮紅，質(zhì)地光滑(圖1-3)，脾臟無腫脹，邊緣光滑，顏色鮮艷(圖1-4)；肺臟顏色鮮艷呈白色、無出血，表面光滑整齊(圖1-5)；腎臟體型飽滿，表面光滑無出血點(圖1-6)?；疾≈袷笙卵烂撀?，被毛雜亂無光澤(圖1-7)；后發(fā)現(xiàn)心包有嚴重無色透明液體、心臟質(zhì)地柔軟凹陷、可見淤血(圖1-8)；肝臟表面光滑分布紅色細血絲，有明顯出血點(圖1-9)；脾臟顏色較為暗沉，表面不粗糙，邊緣呈鋸齒狀(圖1-10)；肺臟表面可見深紅色斑塊(圖1-11)；腎臟呈大理石色，表面凹凸不平(圖1-12)。

由表3可知，當反應時間達到3 h時酶解基本完全，此時的提取率最高。反應時間過長，可能導致水解蛋白質(zhì)變性分解，當反應時間達到3 h時最佳。

2.2 組織病理學觀察結(jié)果

正常健康竹鼠心臟細胞排列緊密，分界清晰，胞質(zhì)豐富，細胞形態(tài)正常，組織結(jié)構清晰明了(黑色箭頭)，無明顯病理變化特征(圖2-1)；肝臟組肝索結(jié)構清晰，肝細胞著色正常，匯管區(qū)細胞分界清晰(黑色箭頭，圖2-2)；脾臟細胞和脾小結(jié)細胞豐富、著色均勻，分界清晰明了(黑色箭頭，圖2-3)；肺臟肺泡壁厚度均勻且較薄(圖2-4)；大量腎小管形狀呈圓形，分界清晰，管內(nèi)充滿大量的紅細胞(黑色箭頭)，腎小球和腎小囊清晰可見其內(nèi)含有大量血紅細胞，形態(tài)正常，無擴增或萎縮現(xiàn)象(黃色、紅色箭頭，圖2-5)。

感染竹鼠可見心臟組織心肌細胞排列緊密，分界清晰，大量心肌細胞胞質(zhì)疏松淡染(黑色箭頭)，間質(zhì)可見少量肥大細胞浸潤(紅色箭頭，圖2-6)；肝臟組織肝索結(jié)構不清，較多肝細胞淀粉樣變，呈嗜酸性均質(zhì)狀(紅色箭頭)，匯管區(qū)周圍膽管增生(黃色箭頭)，并可見極大量的炎性細胞浸潤(綠色箭頭，圖2-7)。脾臟脾小結(jié)數(shù)量大量減少，紅髓淋巴細胞大量減少，并可見大面積淀粉樣變，呈嗜酸性均質(zhì)狀(黑色箭頭)，髓竇可見淤血及出血(紅色箭頭，圖2-8)；肺臟肺泡壁明顯增厚(紅色箭頭)，廣泛可見肺泡出血，肺泡腔內(nèi)大量紅細胞(黑色箭頭，圖2-9)；腎臟皮質(zhì)廣泛可見腎小管上皮細胞空泡變性，胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量不等的微小空泡(綠色箭頭)，大量腎小管擴張，形狀不規(guī)則，管腔內(nèi)可見嗜酸性團塊(黑色箭頭)，少量管腔內(nèi)可見炎性細胞(黃色箭頭)，間質(zhì)少量結(jié)締組織增生(橙色箭頭)，腎小球內(nèi)可見炎性細胞浸潤(紫色箭頭)，少量腎小球萎縮，腎小囊內(nèi)充滿嗜酸性蛋白液(藍色箭頭)，髓質(zhì)大量集合管擴張，并可見出血，管腔內(nèi)大量紅細胞(紅色箭頭，圖2-10)。

3 討論

大腸桿菌是廣泛存在于動物體內(nèi)的一種條件性致病菌[11]，屈孝初等[12]在2000年對大腸桿菌感染引起的竹鼠水腫病進行了首次報道。蘆靜等[13]報道致病性大腸桿菌可引起長白山雜交豬內(nèi)臟充血水腫、心包積液、腎臟伴有針尖大小出血點等病變。其病變組織肝臟肝小葉內(nèi)由淋巴細胞浸潤形成巨核細胞 、肝細胞出現(xiàn)萎縮變性，腎臟內(nèi)大量炎性細胞浸潤等組織病理學變化。呂中鋒[14]報道的大腸桿菌可引起仔豬腸道和胃壁充血并伴有輕微出血、皮下出血，能引起母豬充血性、患急性和化膿性乳腺炎，在對其病變組織進行病理學觀察時發(fā)現(xiàn)中性粒細胞浸潤、減少和淀粉樣蛋白纖維沉淀等。曾喻兵等[15]剖檢感染大腸桿菌的竹鼠發(fā)現(xiàn)肺臟有點狀出血，肝臟腫脹有壞死灶，淋巴結(jié)腫脹等病理特征。其對病變組織進行病理學觀察可見肝索排列紊亂、大量肝細胞廣泛性空泡變性且變性細胞胞漿淡染、門管區(qū)周圍肝細胞呈片狀壞死，胞核固縮等組織病理學變化。潘淑惠等[16]發(fā)現(xiàn)山羊感染偽結(jié)核棒狀桿菌感染組織出現(xiàn)不同程度的腫脹，對病變組織進行病理學觀察發(fā)現(xiàn)皮下組織形成肉芽，有炎性細胞浸潤、肺臟細胞水腫及細胞增生、多臟器淋巴細胞浸潤等病理變化。王振忠等[17]發(fā)現(xiàn)鴨源棒狀桿菌病例可見腹水，腹部皮下及腸壁腸系膜布滿黃白色豆粒狀大小結(jié)，肝臟腫大且出現(xiàn)壞死灶，肝竇擴張，肝細胞淤血，腎小管上皮細胞脫落，脾臟細胞大量的淋巴細胞、巨噬細胞浸潤等病理學變化。張乃嘉等[18]分離的豬源綠色氣球菌可知感染病例心包有明顯積液、心肌出血，肺臟出血，脾臟邊緣出血性梗死，肝臟有出血點，腎臟腫大呈蒼白色，全身淋巴結(jié)腫大、出血等癥狀。李楠等[19]報道綠色氣球菌可造成山羊的真胃、肝臟等內(nèi)臟器官出血，本實驗心臟淤血、心包充滿積液，肝臟出血、腫大，脾臟腫脹，腎臟蒼白色等病變特征與上述文獻報道基本吻合，綜上所述，細菌感染動物不具有特異性，并且同一種細菌感染引起的組織病變也不盡相同。

本實驗對混合感染致病性大腸桿菌、致病性棒狀桿菌和致病性綠色氣球菌的竹鼠內(nèi)臟組織進行組織病理學觀察，發(fā)現(xiàn)送檢竹鼠心臟組織均有心肌細胞，胞質(zhì)疏松淡染、肥大細胞浸潤等病理學變化特征，個別送檢竹鼠心臟組織心肌細胞出現(xiàn)心肌細胞減少被纖維結(jié)締組織取代的病理學變化；肺臟組織肺泡壁厚度不一(表現(xiàn)為肺泡壁變薄或增厚)，廣泛可見肺泡出血并充滿大量紅細胞等相同變化，同時個別竹鼠肺臟組織肺泡擴張或萎縮，局部可見巨噬細胞和炎性細胞浸潤等不同的病理學變化；肝臟組織肝索結(jié)構不清，肝細胞出現(xiàn)淀粉樣變，呈嗜酸性均質(zhì)狀，匯管區(qū)周圍膽管增生并伴隨炎性細胞浸潤(圖2-7，綠色箭頭)；脾臟脾小結(jié)數(shù)量，紅髓淋巴細胞少和淀粉樣變，呈嗜酸性均質(zhì)狀；腎臟腎小球內(nèi)均可見炎性細胞浸潤、腎小管上皮細胞空泡或腫脹，腎臟細胞可見嗜酸性團塊等相同變化，其余腎臟細胞出現(xiàn)腎小管擴張、髓質(zhì)集合管擴張等不同的變化。目前致病性大腸桿菌、致病性棒狀桿菌和致病性綠色氣球菌對竹鼠的致病機理還不清楚，但本研究在排除竹鼠常見病毒病的前提條件下對3例混合感染3種致病性細菌的竹鼠內(nèi)臟組織進行組織病理變化分析發(fā)現(xiàn)，3例混合感染致病性細菌的竹鼠肝臟心包積液、肝臟出血腫大、脾臟腫大、腎臟腫大等相同點，但有點心臟心包和淤血積液程度、個別心臟伴有點狀出血點，腎臟有點表現(xiàn)為腫脹、表面有出血點，但有點在腫脹的同時也伴隨壞死灶等，因此本次送檢樣品的病變特征具有一定差異，綜合分析認為引起內(nèi)臟組織發(fā)生不同的病理變化原因可能與混合感染和感染竹鼠內(nèi)臟組織的細菌濃度等因素有關。大腸桿菌是一普遍存在于人和動物的消化道、呼吸道、泌尿系統(tǒng)內(nèi)一種條件致病菌[20]。棒狀桿菌是一種條件致病菌，人類醫(yī)學相關研究表明棒狀桿菌是人類皮膚常見菌群之一，感染人、豬、家禽等也偶有報道[21-23]。相關學者也有豬源、人源、鴨源、羅非魚源等綠色氣球菌的報道[21-25]，但還未有大腸桿菌、棒狀桿菌和綠色氣球菌混合感染竹鼠和相關病理學變化研究的報道，相關混合感染后引起臨床特征和病理變化尚不明確。因此還需進一步探究才能了解大腸桿菌、棒狀桿菌和綠色氣球菌混合感染的致病機理。

4 結(jié)論

本研究對混合感染致病性大腸桿菌、致病性棒狀桿菌和致病性綠色氣球菌的竹鼠病例組織進行了組織病理學觀察和分析，以期為竹鼠細菌病的研究提供病理學參考資料。