曲鳳儀 孫婷庭 劉書玉 趙振良 薛 原

(東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040)

大腸桿菌(Escherichiacoli)作為一種條件性致病菌，在多種因素引起的機體免疫力下降時可引發(fā)機體感染，更是導致動物腹瀉的眾多原因之一[1]。在大腸桿菌的強毒力菌株中，編碼irp1、irp2、fyuA、ybtA等多種毒力基因的耶爾森菌強毒力島(high island，HPI)和編碼eae等基因的致病性腸細胞脫落位點毒力島(locus of enterocyte effacement pathogenicity island，LEE)經常出現，這些強毒力菌株感染可引起狐(Vulpesvulpes)、貉(Nyctereutesprocyonoides)等毛皮動物死亡。此外，大腸桿菌黏附素的合成也與其致病性有密切聯系[1-4]。

本研究采用了PCR 技術[1]對東北地區(qū)貉養(yǎng)殖場的56株大腸桿菌進行了irp1、irp2、fyuA、ybtA、eae、iucD、fimH、stx1、stx2、iss10種毒力基因的檢測，以獲取各毒力基因存在頻率的大小，為之后大腸桿菌所致流行病的研究與防控提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 細菌菌株

本實驗分離鑒定了東北地區(qū)3個貉養(yǎng)殖場的大腸桿菌菌株，共計56株。

1.2 主要試劑

瓊脂糖，10×Loading Buffer，DNTP，TaqDNA聚合酶，I型核酸染色劑，DL2000 DNA maker等均購自寶生物技術有限公司。

1.3 引物設計

按照參考文獻[1，5-6]設計引物序列iucD，irp2，fyuA，fimH，iss，stx1，ybtA，irp1，stx2，eae。

1.4 PCR擴增

反應體系為18 μL去離子水，2.5 μL 10×Loading Buffer，2.0 μL DNTP，0.5 μL上下游引物，0.25 μLTaqDNA聚合酶，2 μL菌液。

表1 大腸桿菌毒力基因的引物Tab.1 Primers for E.coli virulence genes

2 結果

2.1 貉源大腸桿菌單個毒力基因檢測

對58株貉源大腸桿菌進行PCR檢測：共22株檢出iucD，陽性率為39.29%；21株檢出irp2，陽性率為37.50%；30株檢出fyuA，陽性率為53.57%；54株檢出fimH，陽性率為98.21%；3株檢出ybtA，陽性率為5.36%；其中，相關黏附基因iss，stx1，stx2，irp1在58株貉源大腸桿菌中均無檢出。

2.2 貉源大腸桿菌多個毒力基因的檢出結果

由表2可知，iucD、irp2、fyuA與irp2、fyuA、fimH、ybtA以及iucD、irp2、fyuA、fimH、ybtA分別同為陽性的菌株均有1株，分別占1.79%；irp2、fimH與fyuA、fimH同為陽性的菌株均有3株，占5.36%；iucD、irp2、fyuA、fimH分別同為陽性的菌株均有4株，占7.14%；iucD、fimH同為陽性的菌株有5株，占8.93%；iucD、fyuA、fimH同為陽性的菌株有6株，占10.71%；irp2、fyuA、fimH同為陽性的菌株有9株，分別占16.07%；未發(fā)現有同時攜帶5個以上毒力基因的菌株。

表2 毒力基因檢測結果統(tǒng)計Tab.2 Virulence gene test results statistic

3 討論

大腸桿菌作為一種條件性致病菌，能夠引起人與動物的腸道性疾病，其致病性與黏附素、緊密素和腸毒素等多種毒力因子有關。

此次檢測中iucD、irp2、fyuA、ybtA基因由于地區(qū)的不同，檢出率也有較大差異。iucD基因在h地區(qū)共檢出10株，陽性率為33.33%，在G地區(qū)共檢出12株，陽性率為46.15%；irp2基因在h地區(qū)共檢出9株，陽性率為30%，在G地區(qū)共檢出12株，陽性率為46.15%；fyuA基因在h地區(qū)共檢出10株，陽性率為33.33%，在G地區(qū)共檢出20株，陽性率為76.92%；ybtA基因在h地區(qū)共檢出3株，陽性率為10%，在G區(qū)并未檢測出攜帶菌株，陽性率為0%。由此顯示，不同地區(qū)的不同動物甚至相同動物所攜帶的E.coli基因型有所差異[7]。且根據 Wang 等[8]的研究，大腸桿菌菌株的致病性與毒力相關基因的數量和組合模式密切相關，可以進一步研究。

耶爾森菌HPI最早發(fā)現于耶爾森菌屬(Yersinia)，研究表明其在多種腸桿菌屬的細菌中均有存在，而且可以在耶爾森氏菌(Yersiniavanloghem)和E.coli之間水平傳播，與致病性E.coli的毒力進化密切相關，一些E.coli攜帶的irp2、fyuA序列與耶爾森氏菌的幾乎相同[9]。irp2與fyuA作HPI毒力島的主要組成成分，常作為基因檢測的標志性基因。在此次試驗中，這兩種基因的檢出率較高，然而根據Hu等[10]研究，攜帶fyuA基因無法保證HPI核心功能區(qū)的完整性，而完整的HPI毒力島核心功能區(qū)也并不保證功能性耶爾森菌素的合成[11]。fyuA基因作為HPI的核心基因之一，其編碼產物可以增強大腸桿菌對于鐵的攝取能力以及生物膜的形成，提高大腸桿菌在動物體內逃避免疫機能的能力。

Ⅰ型菌毛中fimH亞單位作為Ⅰ型菌毛的主要組成部分，在介導細菌黏附宿主細胞的同時，為進一步侵入機體創(chuàng)造條件。研究表明，fimH能夠與甘露糖結合發(fā)生凝集，但在D-甘露糖存在的情況下，該凝集性會被抑制。因此，表達Ⅰ型菌毛的細菌能夠黏附多種細胞，如上皮細胞、巨噬細胞、紅細胞等[12]。本次實驗結果顯示fimH的檢出率高達98.21%，同樣，在趙李祥[13]的研究中fimH檢出率也非常高，達到 90%以上。在鐘杏好等[14]的研究中，fimH檢出率也高達87.1%—91.3%，與本實驗結果一致，而fimH檢出率普遍很高，這是否說明這個基因比較穩(wěn)定，以及其在大腸桿菌的生存與定植過程中是否發(fā)揮著不可或缺的作用，是否所有有定植能力的大腸桿菌都有這種毒力基因，種種問題還有待進一步驗證[1]。同時，此實驗中并未檢測出僅攜帶irp2、fyuA基因的菌株，但檢測出了fimH與irp2，fimH與fyuA；未檢測出iucD、eae基因的菌株，卻檢測出了fimH與iucD，fimH與eae；并未檢測出iucD、fyuA基因的菌株，反而檢測出了fimH與iucD，fimH與fyuA。這種現象是否出于偶然，是否說明了fimH存在著其他的功能還需進一步研究。

血清耐受基因(increased serum survival gene，iss)是決定APEC致病因素之一，iss基因存在于ColV質粒上，編碼的蛋白iss屬于外膜蛋白的一部分，與細菌抗補體作用有關，而補體抗性又與毒力高度相關，是重要的致病因素[15]。然而此次實驗中的檢出率為0%，與 Ewers 等[16]的 82.7%有出入，Bonnet 等[17]認為iss為禽致病性大腸桿菌的標志基因之一，而在本次實驗中iss毒力基因并未檢出，是否說明本次檢測的貉源大腸桿菌中不含有iss致病基因還有待進一步研究。

研究表明，大量的菌株可形成一個重要的毒力基因庫，在某些情況下，并與其他因素結合，可能會產生新的致病菌株[1，4，18]。定時對動物飼養(yǎng)場的大腸桿菌進行毒力基因檢測與分析有利于掌握疾病流行現狀，為疾病的防控與治療提供數據支撐。