吳海蘭 李才武 李 果 潘 欣 鄧雯文張貴權(quán) 何永果 黃 炎 張和民 鄒立扣

(1.成都理工大學(xué)旅游與城鄉(xiāng)規(guī)劃學(xué)院，成都，610059；2.中國大熊貓保護(hù)研究中心大熊貓國家公園珍稀動物保護(hù)生物學(xué)國家林業(yè)和草原局重點實驗室，都江堰，611830；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都，611130)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)在長期進(jìn)化過程中已特化出以竹類為食的特點，它們雖有著草食性哺乳動物的進(jìn)食特點，但仍保留著典型肉食性動物的消化系統(tǒng)，其本身不能產(chǎn)生纖維素酶，也不具有編碼纖維素酶的相關(guān)基因[1]。因此，消化竹子的木質(zhì)纖維素的功能需依賴其腸道微生物來完成。短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)是由腸道微生物發(fā)酵膳食纖維、碳水化合物和其他植物營養(yǎng)素在腸道中形成的碳原子數(shù)為1—6個的飽和脂肪酸，主要包含甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異己酸等[2]。研究表明，SCFAs不僅能促進(jìn)宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，還能降低腸道pH值，抑制致病菌的定植，促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖，維持腸道完整性和調(diào)節(jié)腸道免疫等功能[3-4]。SCFAs的種類、數(shù)量主要取決于腸道內(nèi)菌群組成、消化的時間、宿主飲食中的纖維含量以及外源攝入的SCFAs。機體內(nèi)產(chǎn)生的SCFAs一部分被吸收入血液，通過血液循環(huán)參與機體內(nèi)各組織代謝，這是機體從小腸不能直接消化的碳水化合物中獲取能量的主要途徑，僅有少部分(約占總量5%—10%)逃脫吸收隨糞便排出[5]?，F(xiàn)有關(guān)大熊貓腸道研究中更多地側(cè)重于腸道微生物菌群、纖維素酶活性等，尚有關(guān)大熊貓腸道中短鏈脂肪酸的相關(guān)研究。

目前，關(guān)于測定樣品中SCFAs含量的方法多種多樣，包括高效液相色譜(HPLC)結(jié)合紫外(UV)檢測[6]、電化學(xué)檢測(ECD)[7]、質(zhì)譜(MS)[8]或氣相色譜(GC)結(jié)合火焰離子化檢測(FID)[9]和質(zhì)譜法(MS)[10]。在這些方法中，GC/MS法是生物樣品中最常用的SCFAs測定方法，具有較高的靈敏度。SCFAs極性較強，未衍生化的SCFAs在氣相色譜柱中容易產(chǎn)生吸附作用，最好進(jìn)行衍生化樣品預(yù)處理，以降低這些揮發(fā)性酸的蒸發(fā)損失，提高其準(zhǔn)確度和分離度[11]。

本研究對提取了竹子、大熊貓血清及糞便樣本中SCFAs，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)方法對苦竹、大熊貓糞便以及血清中SCFAs進(jìn)行檢測，研究發(fā)現(xiàn)苦竹不同部位SCFAs的含量存在明顯差異。大熊貓采食竹子不同部位，其所含的SCFAs的含量不同，可對腸道以及機體發(fā)育產(chǎn)生一定的生理作用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

收集苦竹(Pleioblastusamarus)樣本共9個，包括竹葉、竹筍和竹竿各3個(每個樣本由3個樣品混合均勻)；圈養(yǎng)大熊貓新鮮糞便樣本6個，血清樣本3個。

1.2 試劑

甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、2-甲基丁酸、戊酸、2-甲基戊酸、4-甲基戊酸、正己酸、正庚酸和磷酸氫二鈉購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。乙酸-d4同位素購買于劍橋同位素實驗室公司。2，3，4，5，6-五氟溴芐(PFBBr)、丙酮和正己烷購于西格瑪-奧德里奇公司。

1.3 短鏈脂肪酸提取和衍生

樣本用液氮研磨成粉末，稱取50 mg左右的竹筍(或竹葉或糞便或100 mg的竹竿)，加入170 μL水、30 μL的0.5M的Na2HPO4溶液、100 μL的100 μg/mL乙酸-d4內(nèi)標(biāo)溶液和600 μL的PFBBr丙酮溶液。60℃水浴反應(yīng)40 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入200 μL的正己烷。3 000 g離心15 min，移取上層正己烷相進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

取100 μL解凍的血清樣本，加入70 μL水、30 μL的0.5 M的Na2HPO4溶液、100 μL的100 μg/mL乙酸-d4內(nèi)標(biāo)溶液和600 μL的PFBBr丙酮溶液。60℃水浴反應(yīng)40 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入200 μL的正己烷。3 000 g離心15 min，移取上層正己烷相進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

制備1 mg/mL的水溶液的12種短鏈脂肪酸混標(biāo)，梯度稀釋得到0.001—0.500 mg/mL混標(biāo)溶液。取20 μL梯度稀釋的混標(biāo)、加入150 μL水、30 μL的0.5 M的Na2HPO4溶液、100 μL的100 mg/mL乙酸-d4內(nèi)標(biāo)溶液和600 μL的PFBBr丙酮溶液。余下步驟同樣本制備。

1.5 氣相色譜-質(zhì)譜檢測分析

采用美國安捷倫公司的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(型號7890A/5975C)和德國MACHEREY-NAGEL公司 OPTIMA WAXplus?熔融硅毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)對衍生的樣本進(jìn)行短鏈脂肪酸定量檢測分析。載氣為高純(純度大于99.999%)氦氣，流速1 mL/min。采用梯度升溫程序?qū)颖具M(jìn)行分離分析。梯度升溫程序為：起始爐溫為60℃并維持2 min，以20℃/min升到100℃，以2℃/min升到110℃，以10℃/min升到160℃，繼續(xù)以20℃/min升到240℃并維持2 min。樣本以無分流模式進(jìn)樣1 μL，溶劑延遲時間設(shè)定為9 min。進(jìn)樣口、傳輸線和電子碰撞(EI)電離源溫度分別設(shè)定為250℃、250℃和230℃。EI能量設(shè)定為70電子伏。采用選擇離子模式對數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCFAs色譜圖

將樣品按照上述色譜條件下進(jìn)行測定，確定各種酸的保留時間以及定量離子質(zhì)荷比，結(jié)果如表1所示。樣品中12個短鏈脂肪酸分別是甲酸、乙酸、異丁酸、丙酸、2-甲基丁酸、丁酸、異戊酸、2-甲基戊酸、戊酸、己酸、庚酸、4-甲基戊酸。SCFAs總離子流圖譜如圖1所示，能夠同時分離12種不同的SCFAs，且在圖譜中分離良好，內(nèi)標(biāo)物乙酸-d4與其他目標(biāo)峰位相近且分離度良好，互相之間無干擾，適合SCFAs 的分離和鑒定。

2.2 定量分析方法學(xué)考察

將12種SCFAs配制成不同級別的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以對照品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過繪制所得的曲線進(jìn)而得到線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表2所示。各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.12%—8.82%(n=6)。

表1 12種短鏈脂肪酸的保留時間Tab.1 Retention times of 12 short-chain fatty acids

表2 12種短鏈脂肪酸的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)，線性范圍和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.2 Linear regression equation，correlation coefficient，linear range and relative standard deviation of 12 kinds of short-chain fatty acids

續(xù)表2

2.3 竹子中SCFAs含量

采用該方法進(jìn)一步測定苦竹、大熊貓糞便和血清樣品中的SCFAs含量，4-甲基戊酸含量在定量限以下，各樣本中難以檢測出?？嘀袼袠颖局袡z測到的主要SCFAs包括乙酸、甲酸、正己酸和丙酸，其平均含量分別為61.39、42.06、8.43和6.30 μg/g(圖2A)。從表3可以看出SCFAs在苦竹不同部位中的分布存在明顯差異，除竹筍中異丁酸、2-甲基丁酸、丁酸、異戊酸的含量較竹葉和竹稈高外，其余SCFAs都以竹葉中含量較高，竹稈中各SCFAs含量都較低(圖2B)。

表3 苦竹不同部位中SCFAs的含量Tab.3 Content of SCFAs in different parts of bitter bamboo

續(xù)表3

2.4 大熊貓糞便中SCFAs含量

糞便樣品中檢測到的主要SCFAs包括乙酸、甲酸、丙酸、異丁酸和丁酸，其平均含量分別為152.37、61.76、3.92、1.11和0.88 μg/g；2-甲基戊酸和戊酸含量較低(圖3)。

2.5 大熊貓血清中SCFAs含量

血清樣本中檢測到的主要SCFAs包括甲酸、乙酸、丙酸和正庚酸，其平均含量分別為7.32、4.71、3.24和0.74 μg/mL；異戊酸和戊酸含量較低(圖4)。其中甲酸含量較高，這可能與生物體腸道內(nèi)所產(chǎn)生相應(yīng)的SCFAs以及被吸收利用的比例有關(guān)。

3 討論

3.1 主食竹、糞便和血清中短鏈脂肪酸的GC/MS分析

SCFAs生理活性較強，是維持生物體腸道健康和體內(nèi)環(huán)境平衡的重要物質(zhì)，并能發(fā)揮多種腸道和系統(tǒng)性效應(yīng)。生物體內(nèi)的SCFAs含量受腸道微生物群與飲食之間的復(fù)雜相互作用影響[12-14]。近年來，越來越多的研究確定了SCFAs在腸道微生物群、飲食和宿主之間相互作用中的重要作用[15]。由于SCFAs易揮發(fā)，從而導(dǎo)致樣品定量不準(zhǔn)確，重復(fù)性差。本文中采用將樣品進(jìn)行PFBBr衍生化后提取，并通過用正己烷萃取實現(xiàn)衍生化產(chǎn)物的最佳提取效率。在上述內(nèi)容的基礎(chǔ)上，建立了對大熊貓主食竹、糞便和血清樣本中12種SCFAs檢測的GC/MS定量方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考證。結(jié)果表明12種 SCFAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好線性，R2均大于0.999，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低，表現(xiàn)出良好的重復(fù)性和精密度。

3.2 主食竹不同部位中SCFAs的含量差異及其生理作用

研究表明，在苦竹不同部位中主要的SCFAs含量存在差異。除竹筍中異丁酸、2-甲基丁酸、丁酸、異戊酸的含量較竹葉和竹莖高外，其余的SCFAs都以竹葉中含量最高。竹筍中丁酸可轉(zhuǎn)化為β-羥丁酸而為機體供能，2-甲基丁酸、異戊酸和異丁酸合稱為異位酸，異位酸不僅能促進(jìn)機體腸胃對食物中結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解[16]，還能促進(jìn)纖維降解菌群的生長，從而有利于纖維物質(zhì)的消化。除此，2-甲基丁酸可以提高食物的適口性，也有研究表明在雌性泌乳中期食物中添加異丁酸，可使產(chǎn)奶量和體重增加[17]。這表明竹筍對于大熊貓而言不僅適口性好，營養(yǎng)價值高利于消化，且在雌性泌乳撫育幼仔期，采食竹筍有利于產(chǎn)奶以及補充體能。

竹葉中乙酸、甲酸、正己酸和丙酸含量較高，從苦竹中檢測出的主要SCFAs含量與在生物體內(nèi)起主要生理作用SCFAs的生成順序乙酸>丙酸>丁酸相似[18]。乙酸到達(dá)門靜脈循環(huán)，隨血液進(jìn)入全身循環(huán)作為周邊組織的能源。丙酸作為糖異生前體物質(zhì)產(chǎn)生的葡萄糖能滿足動物30%—50%的能量需求，乙酸、丙酸和丁酸被腸黏膜上皮細(xì)胞吸收后均能作為其重要的能量來源[19]。Tong 等[20-21]研究表明，丙酸、丁酸等能增加腸上皮細(xì)胞密切連接蛋白ZO-1等的表達(dá)，減少促炎因子的生成，有利于黏膜炎癥的修復(fù)以增強腸黏膜的機械屏障功能?？苌萚22]研究發(fā)現(xiàn)，食物中添加丁酸鈉可以促進(jìn)動物斷奶后的生長以及提高腸道消化酶活性。成年大熊貓因其腸道發(fā)育的完整性以及腸道微生物群落的豐富性[23]，竹竿是其常食部分，斷奶后的幼體和衰老個體，以竹葉為主食，竹葉中富含的乙酸、丙酸和丁酸，不僅有利于這些腸道發(fā)育不足或年老的個體對竹子中纖維素的消化，從而保證腸道功能的完整性，還能減少相關(guān)疾病的發(fā)生。目前大多研究僅停留在乙酸、丙酸、丁酸3種短鏈脂肪酸對于機體生理作用的探究，關(guān)于樣本中含量較高的甲酸以及其他短鏈脂肪酸在機體中發(fā)揮什么作用仍需進(jìn)一步的探索。

3.3 短鏈脂肪酸在主食竹、糞便以及血清中相關(guān)性分析

糞便與血清中主要以甲酸和乙酸為主，腸道中產(chǎn)生的主要SCFAs在吸收進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)前，大量的丙酸、丁酸會被形成腸壁的腸細(xì)胞吸收，從而用于生產(chǎn)能量。部分吸收未被消耗的SCFAs，例如乙酸則通過基底外側(cè)膜釋放到肝門靜脈，并通過肝臟進(jìn)入血液到達(dá)全身循環(huán)，外周肌肉組織通過代謝這些未改變的脂肪酸以產(chǎn)生能量[24]，其余未被吸收或逃脫吸收的SCFAs則隨糞便排出。因此，糞便與血清中SCFAs的含量與機體腸道內(nèi)產(chǎn)生的SCFAs密切相關(guān)?，F(xiàn)有研究表明，生物體腸道內(nèi)SCFAs的總量與外源添加SCFAs和日糧纖維的含量成正相關(guān)性[25]。竹子作為大熊貓的主食，大量的纖維素和木質(zhì)素又屬于不溶性纖維，具有高度的可發(fā)酵性，能在生物體腸道中產(chǎn)生更多的SCFAs[26]，其自身富含的SCFAs也能為機體補充相應(yīng)的SCFAs。糞便以及血清中的SCFAs濃度在一定程度上可反映腸道產(chǎn)生的SCFAs濃度，因此，竹子中的短鏈脂肪酸與糞便、血清中的短鏈脂肪酸具有一定的相關(guān)性。

4 結(jié)論

本文利用GC/MS方法，對于苦竹、大熊貓糞便及血清中的短鏈脂肪酸進(jìn)行分析及測定。研究發(fā)現(xiàn)苦竹中SCFAs的含量在其不同部位存在差異，這些SCFAs對大熊貓機體產(chǎn)生一定的生理作用，能促進(jìn)大熊貓腸道對竹子中的纖維素的消化以及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，維持腸道健康等功能。研究探討了苦竹、大熊貓糞便及血清中的SCFAs存在的相關(guān)性，以上結(jié)果能為進(jìn)一步研究探討大熊貓食性研究提供了數(shù)據(jù)支撐。后續(xù)需結(jié)合大熊貓腸道中產(chǎn)生的SCFAs來進(jìn)一步驗證主食竹、血清以及糞便中SCFAs含量的相關(guān)性，以及腸道中SCFAs的生理作用。