趙會成，劉夢帥，陳帥民，王新珍，王仕琴，胡春勝，劉彬彬，王鳳花**

(1.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心/中國科學(xué)院農(nóng)業(yè)水資源重點實驗室/河北省土壤生態(tài)學(xué)重點實驗室 石家莊 050022； 2.中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，合理施用氮肥在保障糧食作物穩(wěn)產(chǎn)、增產(chǎn)中起著重要作用。然而，隨著集約化農(nóng)業(yè)發(fā)展進程的加快，過量施用氮肥的現(xiàn)象日益增加，由此引起的土壤硝酸鹽累積、地下水硝酸鹽污染、溫室氣體排放以及土壤酸化等問題日趨嚴重[1]。華北平原農(nóng)田區(qū)作為我國主要的糧食主產(chǎn)區(qū)之一，氮肥年施用量高達500 kg(N)·hm-2·a-1[2]，遠超作物“最適的”氮肥需求量[286 kg(N)·hm-2·a-1][3]。目前，該地區(qū)農(nóng)業(yè)氮肥施用已造成0～12 m 土壤剖面硝酸鹽的大量累積，成為潛在的污染源，最終通過強降雨或灌溉進入地下水，造成污染[4]。已有研究表明典型厚包氣帶農(nóng)田區(qū)淺層地下水中硝酸鹽污染超標率高達50%，而深層地下水中硝酸鹽的污染程度也在逐年加劇[5]。因此，如何削減厚包氣帶土壤硝酸鹽污染是集約化農(nóng)田區(qū)面臨的最重要問題。

包氣帶是指地表到地下水之間的非飽和帶，既是土壤硝酸鹽淋失的通道，也是土壤硝酸鹽累積、轉(zhuǎn)化和削減的場所。其中，土壤硝酸鹽自修復(fù)作用是削減厚包氣帶土壤累積硝酸鹽的重要途徑。土壤中的反硝化微生物，可將土壤中累積的硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氣態(tài)產(chǎn)物(N2O、NO 和N2)[6]，又經(jīng)土壤孔隙消散到大氣中，完成厚包氣帶土壤硝酸鹽污染的自修復(fù)過程，是阻控厚包氣帶土壤硝酸鹽淋失的有效途徑。研究表明，反硝化細菌約占土壤微生物總數(shù)的5%[7]，但并不是所有的反硝化細菌都具有完全反硝化能力，有些反硝化細菌在反硝化過程中會產(chǎn)生N2O 等中間產(chǎn)物。N2O 會對臭氧層造成破壞，是導(dǎo)致全球變暖現(xiàn)象出現(xiàn)的主要溫室氣體之一[8]，它吸收熱量的能力是CO2的300 倍[9]。因此篩選具有完全反硝化能力的菌株，將累積的硝酸鹽最終還原為N2，對削減包氣帶土壤累積的硝酸鹽具有重要的應(yīng)用價值。

目前，國內(nèi)外關(guān)于反硝化微生物的報道多來自于表層土壤[10-11]，例如王惠芬等[12]通過采集表層3～5 cm 的土壤分離出6 株具有反硝化能力菌株。陳寒玉等[13]從蔬菜大棚表層0～20 cm 的土壤分離出1 株反硝化細菌并進行土壤脫氮效果研究。Falk 等[14]從表層0～10 cm 的土壤篩選出490 株細菌，其中8株菌株攜帶nirK 功能基因。盡管包氣帶微生物具有提高反硝化活性的潛力，但目前對厚包氣帶及含水層土壤中反硝化微生物的研究相對較少。此外，土壤微生物的反硝化過程受土壤含水量、溫度、硝酸鹽濃度以及可利用碳等因素的影響，其中土壤pH對微生物反硝化過程尤為重要[15]。有研究表明，過量施氮肥會導(dǎo)致土壤pH 降低，造成土壤N2O 排放速度加快[15-16]。?imek 等[17]研究表明在酸性土壤中反硝化作用生成的N2O/N2的比例高于堿性土壤。

本研究依托中國科學(xué)院欒城農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)試驗站，從農(nóng)田包氣帶及含水層土壤中篩選到62 株細菌。采用16S rRNA 基因序列分析對菌株進行初步鑒定，同時選取代表性菌株對其生長和反硝化特性進行初步分析，旨在為微生物強化治理厚包氣帶土壤硝酸鹽污染的應(yīng)用提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究依托中國科學(xué)院欒城農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)試驗站，該試驗站位于河北省石家莊市欒城區(qū)(37°53′N，114°41′E)，海拔50.1 m，屬暖溫帶半濕潤季風(fēng)氣候，土壤類型以潮褐土為主。長期施氮肥定位試驗始于 1997年，供試土壤采集于長期施氮量為600 kg(N)·hm-2·a-1的處理。土壤樣品采集于2016年6月，利用Geoprobe (Geoprobe Model 54D，美國)土壤深層采樣機鉆取0～150 m 的土壤樣品，根據(jù)土壤質(zhì)地，選取代表性土層進行微生物分離。土壤樣品分為13.3～16.0 m (L1)、16.0～20.0 m (L2)、30.2～39.0 m (L3)、44.0～50.0 m (L4)、50.0～54.0 m (L5)、65.0～70.0 m (L6)、70.0～80.0 m (L7)、81.0～91.0 m(L8)、91.0～96.0 m (L9)、107.0～110.0 m (L10)、117.0～120.0 m (L11)、120.0～126.7 m (L12)、129.0～130.3 m (L13)和141.0～150.0 m (L14)共14 個土層。分別將上述各土壤剖面土柱樣品混勻后裝入自封袋，并置于冰上，運回實驗室進行微生物篩選工作。

1.2 反硝化細菌的篩選與鑒定

1.2.1 培養(yǎng)基

固體TSA 培養(yǎng)基[18]： 胰蛋白胨15.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1.0 L。

液體TSB 培養(yǎng)基[18]： 胰蛋白胨15.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，氯化鈉5.0 g，加蒸餾水至1.0 L。

固體LB 培養(yǎng)基： 胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1.0 L。

土壤浸提液培養(yǎng)基： 牛肉膏3.0 g，胰蛋白胨5.0 g，瓊脂15.0 g，土壤浸汁1.0 L。

所有培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)pH 至7.2～7.4，121 ℃、30 min高壓蒸汽滅菌。

1.2.2 反硝化細菌的分離與純化

采用平板稀釋涂布法分離反硝化細菌： 稱取5.0 g 新鮮土壤加入無菌水20 mL，28 ℃，180 r·min?1搖床振蕩1 h 后，取出靜置。取上清液并用無菌水進行稀釋，稀釋梯度為10-2和10-3。將稀釋后的土壤上清液分別涂布在含有 KNO3(2 mmol·L?1)的TSA 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基和土壤浸提液培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)袋中于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)菌落顏色、形態(tài)等挑選單菌落，并經(jīng)多次劃線純化后，將純化后的單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，采用甘油水溶液(50%)保存于?80 ℃冰箱中。

1.3 細菌的鑒定

1.3.1 分子生物學(xué)鑒定

對于細菌16S rRNA 基因的擴增，選用細菌的通用引物對27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[19]。PCR 擴增體系50 μL，包括2×GoldStar-Mix (康為世紀，北京) 25 μL，正反向引物各 0.5 μL (10 μM)，DNA 模板1 μL，滅菌超純水23 μL。PCR 擴增程序如下： 95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min； 72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物由生工生物工程股份有限公司測序完成，測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站進行BLAST 在線比對，并使用MEGA 4.0[20]軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 反硝化功能測定

預(yù)培養(yǎng)階段： 250 mL 三角瓶中加入50 mL 1/10 TSB 液體培養(yǎng)基，分別接種純化后的菌株，接菌量為1 mL。置于磁力攪拌器上，700 r·min?1，28 ℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)10 h 后，采用紫外可見分光光度計(UV-6100S，上海)測定菌液在 600 nm 處的吸光度值(OD600)，并確保該值小于0.5。

反硝化功能測定： 120 mL 血清瓶中加入50 mL 1/10 TSB 培養(yǎng)基(含KNO32 mmol·L?1)，使用丁基膠塞和中空鋁蓋進行密封。利用真空抽洗氣裝置將血清瓶內(nèi)的空氣置換為氦氣，并添加 1%的氧氣，加快反硝化細菌的增殖速度。按照吸光值×接種量=0.5 的原則，將菌液接種于血清瓶內(nèi)，立即將血清瓶置于氣體自動采樣培養(yǎng)裝置[21]，700 r·min?1，28 ℃恒溫培養(yǎng)，采用氣相色譜儀(Agilent 7890A，美國)測定血清瓶內(nèi)的N2O 和N2的濃度，每隔2 h進行一次采樣。

1.3.3 形態(tài)特征檢測

細菌電鏡照片采用逐點成像的方法，將樣品圖像特征按順序成比例的轉(zhuǎn)化為圖像信號。具體過程為預(yù)先向培養(yǎng)皿中放入尺寸大小不同的蓋玻片，加入適量TSB 液體培養(yǎng)基并接種目的菌種，密封后28 ℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長期。移液器緩緩移除菌液，只保留蓋玻片和菌團，加入10 mL PBS 溶液(NaCl 8 g·L?1； KCl 0.2 g·L?1； Na2HPO41.44 g·L?1； KH2PO40.24 g·L?1，pH 7.4)清洗菌體。加15 mL 戊二醛溶液(2.5%)進行室溫避光固定。再用乙醇脫水后，即刻用臨界點干燥儀(Leika EM CPD300，德國)干燥1.5 h。最后將干燥后的蓋玻片固定在銅臺，使用真空鍍膜儀(Leika EM SCD050，德國)噴金處理后置于掃描電鏡(Phenom ProX，荷蘭)的樣品臺模塊，按照高倍聚焦、低倍成像的順序進行觀察并拍照保存。

1.3.4 細菌運動性檢測

采用半固體穿刺法對細菌運動性進行檢測。50 mL離心管中加入45 mL 半固體培養(yǎng)基，滅菌牙簽蘸取菌液后，刺入半固體培養(yǎng)基中，拔出牙簽，過夜培養(yǎng)。使用透射光源目測的方式觀察細菌運動性，若觀察到細菌僅生長在穿刺線上，且存在明顯的邊緣界限，則表示細菌不具有運動特性； 反之，若觀察到細菌沿著穿刺線向其四周生長擴散并呈現(xiàn)云霧狀，則表示細菌具有運動性。

1.4 pH 對反硝化細菌功能的影響

120 mL 血清瓶中加入50 mL 1/10 TSB 培養(yǎng)基，添加KNO3終濃度為2 mmol·L?1，分別通過磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH 為5.8、6.2、6.6、7.0、7.4 和7.8，接種具有完全反硝化能力的菌株L103，接菌量為1 mL，將血清瓶置于氣體自動采樣培養(yǎng)裝置[21]，700 r·min?1，28 ℃恒溫培養(yǎng)，使用氣相色譜儀(Agilent 7890A，美國)測定血清瓶內(nèi)的N2O和N2的濃度，每隔2 h進行一次采樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化的反硝化菌株

本試驗共篩選得到 62 株潛在的反硝化菌株，16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖1 所示，篩選到的 6 2 株菌株分別與變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)中的 9 個屬，即與不動細菌屬(Acinetobacter，35 株)、假單胞菌屬(Pseudomonas，15株)、陰溝腸桿菌屬(Enterobacter，3 株)、叢毛單胞菌屬(Comamonas，3 株)、微球菌屬(Micrococcus，2 株)、芽孢桿菌屬(Bacillus，1 株)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus，1 株)、副球菌屬(Paracoccus，1 株)以及氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga，1 株)具有較高的同源性。根據(jù)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果，挑選其中7株親緣關(guān)系較遠的菌株(L37、L71、L96、L103、L104、L133 和L13)進行后續(xù)反硝化功能研究。

2.2 細菌反硝化功能驗證

選取菌株L37、L71、L96、L103、L104、L133和L13 進行反硝化功能試驗。結(jié)果表明，在厭氧條件下，菌株L37、L96、L104 和L133 均不能產(chǎn)生N2O和N2，初步推測這些菌株不具備反硝化能力。菌株L71、L13 和L103 具有反硝化功能(圖2)。其中菌株L71 在第4 h 開始產(chǎn)生N2O，N2O 產(chǎn)生速率從第8 h開始勻速增長，第18 h 反應(yīng)結(jié)束。菌株L13 在第3 h開始產(chǎn)生N2O，N2O 產(chǎn)生速率從第5 h 開始勻速增長，第8 h 反應(yīng)結(jié)束。此外，菌株L103 是唯一能夠在反硝化過程中產(chǎn)生N2的反硝化細菌，從第4 h 開始產(chǎn)生N2O，第9 h 達峰值，隨后N2O 濃度迅速下降，到第10 h N2O 濃度為0； 而N2在第7 h 開始產(chǎn)生，第10 h N2產(chǎn)量達峰值。結(jié)果表明，菌株L103 具備完全反硝化能力，經(jīng)計算得到其反硝化速率高達1.62～2.36 g(KNO3)·d?1·L?1。

2.3 反硝化細菌的形態(tài)特征及生物學(xué)特性

電鏡觀察結(jié)果表明，反硝化菌株L71、L13 和L103 均為桿狀細菌，長度分別為1.0 μm、1.5 μm 和1.5 μm，且都不具有鞭毛(圖3)。菌株運動性試驗結(jié)果表明(表1)，菌株L71 和L13 僅在穿刺物的位置上生長，與半固體培養(yǎng)基存在明顯界限，說明菌株L71 和L13 沒有運動能力。而菌株L103 則沿著穿刺物中心向其四周呈現(xiàn)云霧狀擴散，與培養(yǎng)基界限不明顯，表明菌株L103 具有運動能力。

表1 菌株L71、L13 和L103 的生物學(xué)特性Table 1 Biological features of the selected strains L71，L13 and L103

2.4 pH 對細菌L103 反硝化功能的影響

菌株L103 在pH 5.8、6.2、6.6、7.0、7.4 和7.8條件下的反硝化功能結(jié)果如表2 所示。在pH 7.8 條件下反硝化速率最大，最大反硝化速率隨著pH 的降低而降低。在pH 6.2 和pH 5.8 條件下菌株L103的反硝化活性受到抑制。因此挑選pH 6.6 和pH 7.4條件下，添加1%的氧氣，進一步探究菌株L103 在反硝化過程中NO、N2O、N2和O2的變化情況(圖4)。結(jié)果表明，在pH 7.4 的條件下，O2在第12 h 時完全耗盡，第6 h 開始產(chǎn)生NO、N2O 和N2。NO 在第8 h時達到峰值，隨后NO 濃度降低，到第10 h，濃度降為0。N2O 在第10 h 達到峰值，之后濃度降低，在第12 h 時產(chǎn)量為0。而N2在第8 h 產(chǎn)生速率逐漸加快，之后保持穩(wěn)定，直到第12 h 時濃度不再增加。在pH 6.6 的條件下，O2在第20 h 時完全耗盡，NO 的峰值出現(xiàn)在第28 h。N2O 則在第10 h 和第45 h 出現(xiàn)峰值，最大峰值出現(xiàn)在第45 h，之后濃度快速下降，到第55 h時濃度為0。N2則是在第28 h 時才開始產(chǎn)生，并在第58 h 時達到峰值。上述結(jié)果可以表明，與pH 7.4 相比，菌株在pH 6.6 的條件下反硝化活性受到抑制。

表2 菌株L103 在不同pH 下將KNO3 還原成N2 所需時間及最大反硝化速率Table 2 Time consumed to reduce KNO3 to N2 and max denitrification rate of the strain L103 at different pH

3 討論和結(jié)論

本研究從華北平原長期施氮肥的農(nóng)田厚包氣帶土壤及含水層中共篩選到62 株潛在的反硝化細菌，測序結(jié)果表明這62 株菌株分別與變形菌門、放線菌門、厚壁菌門中的9 個屬具有較高的同源性。深層包氣帶土壤中環(huán)境因子和微生物群落結(jié)構(gòu)與表層土壤存在很大差異[22]。盡管表層土壤中人為施肥、動植物殘體的分解、根系分泌物的產(chǎn)生等因素，使得表層土壤中富含微生物所需的有機碳等營養(yǎng)元素，但由于土壤吸附、微生物分解以及作物根系吸收等，表層土壤中富含的養(yǎng)分很難進入深層土壤中，這就導(dǎo)致深層土壤環(huán)境變得更為貧瘠，微生物豐度和多樣性也變得很低。研究表明，變形菌門在各種土壤環(huán)境中占主導(dǎo)地位，包括養(yǎng)分受限的環(huán)境[22]； 厚壁菌門能夠產(chǎn)生孢子，可抵御惡劣的環(huán)境條件[23-24]。此外發(fā)現(xiàn)篩選到的這62 株菌株中，35 株菌株和15株菌株分別與不動桿菌屬及假單胞菌屬具有很高的同源性，這與不動桿菌屬[24]和假單胞菌屬[22]在反硝化過程中起關(guān)鍵作用的報道一致。Chen 等[22]通過反硝化潛勢的測定以及反硝化功能基因的定量試驗也證實了包氣帶土壤中反硝化微生物的存在。

集約化農(nóng)田往往依靠施加大量氮肥和灌溉來提高作物產(chǎn)量，未被植物利用的氮素會在土壤中累積，進而通過淋溶進入到地下水，對地下水水質(zhì)安全造成威脅[25]。而深層土壤中存在的反硝化微生物可通過微生物的反硝化過程，完成土壤硝酸鹽的自修復(fù)，對削減深層包氣帶土壤累積的硝酸鹽、保障地下水安全具有重要的作用。同時，包氣帶土壤微生物的反硝化作用受到多種因素的影響，比如反硝化微生物的豐度及土壤有機碳、硝態(tài)氮和氧氣含量等。其中，土壤有機碳是驅(qū)動反硝化作用進行的能源物質(zhì)，決定了土壤中反硝化作用的強弱，是限制深層土壤反硝化作用的關(guān)鍵因素[22]。此外，自然界中并不是所有的反硝化細菌都具有完全反硝化能力，土壤中存在完全和不完全反硝化細菌[26]，這些不完全反硝化細菌在反硝化過程中會產(chǎn)生NO、N2O 等中間產(chǎn)物，是環(huán)境中N2O 主要的排放源[27-28]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，菌株L71 和L13 是不完全反硝化菌株，只能將硝酸鹽底物還原為N2O。只有菌株L103 能夠進行完全反硝化能力，可以將硝酸鹽底物完全還原為N2，其反硝化速率高達1.62～2.36 g (KNO3)·d?1·L?1，具備實際應(yīng)用潛力。進一步根據(jù)菌株L103 的全基因組測序結(jié)果表明，該菌株含有反硝化過程的4 個步驟所必需的4 種反硝化功能基因[29]，此結(jié)果與細菌的反硝化潛勢測定結(jié)果相吻合。

與此同時，長期施氮肥引起的土壤酸化問題也日益嚴重[30]。土壤酸化會加快農(nóng)田土壤N2O 的排放速度，加劇溫室氣體的影響[15-17]。本試驗中菌株L103 在不同pH 條件下反硝化潛勢的結(jié)果表明，在培養(yǎng)過程中菌株L103 的反硝化過程受到pH 的影響，低pH 影響反硝化速率，尤其是N2O 還原為N2的速率。有研究發(fā)現(xiàn)氮相關(guān)功能微生物比較適宜生存在中性或弱堿性環(huán)境中[31]。也有研究表明土壤pH 可影響反硝化酶Nos 的活性，當(dāng)pH>7 時，反硝化酶Nos 的活性增強，而當(dāng)pH<7 時，反硝化酶Nos 的活性降低，而其他反硝化酶活性增強，從而導(dǎo)致反硝化過程產(chǎn)生更多的N2O[32]。

綜上所述，本研究結(jié)果對理解微生物在土壤硝酸鹽污染反硝化自修復(fù)過程中的作用機制、利用微生物資源增強包氣帶土壤硝酸鹽污染的自修復(fù)過程，從而削減農(nóng)田土壤硝酸鹽積累具有重要的指導(dǎo)意義。但目前對于反硝化細菌的實際應(yīng)用還處于探索階段，更多的機制和高效反硝化細菌的工程應(yīng)用尚待深入研究。