楊勇，朱家紅，于正璽

(貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽 550081)

0 引言

對(duì)免疫系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的增加和免疫調(diào)節(jié)技術(shù)的出現(xiàn)開創(chuàng)了腫瘤治療的新紀(jì)元，使免疫治療可以成為繼手術(shù)、放療、化療和靶向治療方法之后腫瘤治療相關(guān)領(lǐng)域最成功的療法之一[1]。目前，腫瘤免疫治療主要包括過繼細(xì)胞免疫治療、檢查點(diǎn)抑制劑和治療性癌癥疫苗。免疫檢查點(diǎn)分子包括程序性細(xì)胞死亡受體-1(PD-1)和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)。與CTLA-4 抑制劑相比，檢查點(diǎn)阻斷啟動(dòng)PD-1/程序性死亡受體配體-1(PD-L1)軸具有更高的療效和更少的副作用[2]，此外，PD-1/PD-L1 檢查點(diǎn)抑制劑在黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤患者中顯示出了持久的抗腫瘤效果和安全性[3]，這使得PD-1/PD-L1 抑制劑成為一種更有前景和更有效的抗癌治療方法。為了確保免疫系統(tǒng)在對(duì)外來抗原做出反應(yīng)時(shí)不會(huì)傷害宿主，人類進(jìn)化出了免疫檢查點(diǎn)蛋白和機(jī)制來快速停止免疫反應(yīng)[4]。然而，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，可能存在多種免疫抑制機(jī)制，從而妨礙有效的抗腫瘤免疫[5]。PD-1 及其配體PD-L1 檢查點(diǎn)信號(hào)通路是一對(duì)負(fù)性免疫共刺激分子，許多研究表明，PD-1/PD-L1 信號(hào)通路參與了多種免疫細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)過程，在腫瘤免疫逃逸中起著關(guān)鍵作用。

1 PD-1/PD-L1 信號(hào)通路概述

1.1 PD-1 的結(jié)構(gòu)與表達(dá)

PD-1 又稱CD279，是一種免疫抑制性受體，屬于免疫球蛋白超家族成員的I 型跨膜糖蛋白，其相對(duì)分子量為55000-60000,包括胞外氨基酸頭部、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞漿區(qū)氨基酸尾部。胞外區(qū)由一個(gè)IgV 樣結(jié)構(gòu)域組成，含有多個(gè)重要的N 連接糖基化位點(diǎn)，該區(qū)域能夠與其配體結(jié)合，進(jìn)而抑制免疫細(xì)胞的活化；其胞質(zhì)尾區(qū)包含兩個(gè)酪氨酸殘基，即免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM),其中ITIM 能夠恢復(fù)胞質(zhì)段的磷酸化，發(fā)揮拮抗抗原受體信號(hào)的功能[6,7]。PD-1主要在外周的CD4+、CD8+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞表面、樹突狀細(xì)胞及部分腫瘤細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞表面廣泛表達(dá)。國(guó)外研究[8]顯示，PD-1 也表達(dá)于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg)，可以促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞分化為Treg 細(xì)胞，使Treg 細(xì)胞活性增強(qiáng)，在免疫調(diào)節(jié)過程中扮演重要角色。

1.2 PD-Ll 的結(jié)構(gòu)與表達(dá)

PD-l 的配體PD-LI 又稱CD274，是由290 個(gè)氨基酸組成的I 型跨膜糖蛋白，定位于人類9p24 染色體，具有負(fù)向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能，主要由一個(gè)lgV 樣區(qū)、IgC 樣區(qū)、跨膜疏水區(qū)及30 個(gè)氨基酸構(gòu)成的胞內(nèi)區(qū)組成，其中IsV 樣區(qū)與IgC 樣區(qū)參與細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，胞內(nèi)區(qū)則與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有密切關(guān)聯(lián)[9]。PD-L1 不僅在活化的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)也表達(dá)于其他多種組織細(xì)胞如血管上表皮細(xì)胞、肝臟、心臟、胰島細(xì)胞、多種間質(zhì)細(xì)胞及胎盤組織中表達(dá)[10]。此外，該配體在許多癌癥中的表達(dá)能力較正常組織明顯調(diào)高[11]，例如非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等，提示PD-L1 參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在抑制腫瘤免疫反應(yīng)方面起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[12], 干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-10 等多種細(xì)胞因子可通過上調(diào)PD-L1 分子在不同組織細(xì)胞中表達(dá)。

2 免疫細(xì)胞相關(guān)PD-1/PD-L1 檢查點(diǎn)通路

2.1 T 細(xì)胞相關(guān)PD-1/PD-L1 檢查點(diǎn)通路

腫瘤微環(huán)境中的浸潤(rùn)C(jī)D8 ＋T 細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，能夠分泌IFN-γ及穿孔素等細(xì)胞因子，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。在腫瘤微環(huán)境的背景下，抗腫瘤T 細(xì)胞從腫瘤發(fā)生的初期到轉(zhuǎn)移灶的形成過程中，持續(xù)識(shí)別相關(guān)的腫瘤抗原。T 細(xì)胞抗原受體(TCR)的激活會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中的IFN-γ是刺激腫瘤細(xì)胞PD-L1 表達(dá)的最有力驅(qū)動(dòng)因素[13,14]。此外，IFN-γ在微環(huán)境中的慢性表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致浸潤(rùn)的T 細(xì)胞上PD-1 的表達(dá)升高。腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)的PD-L1 識(shí)別抗腫瘤T細(xì)胞上的PD-1 后，不僅抑制T 細(xì)胞免疫刺激因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)的分泌，而且促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞因子(IL-10)的分泌，從而使T 細(xì)胞的活化和增殖受到抑制[15]。最終，腫瘤細(xì)胞逃脫了免疫細(xì)胞的破壞而發(fā)生增殖和轉(zhuǎn)移。該機(jī)制一直被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的相同途徑。類似也研究表明[16,17]，在受到腫瘤微環(huán)境中免疫抑制細(xì)胞及因子的作用后，活化的CD8＋T 細(xì)胞往往會(huì)轉(zhuǎn)化成為耗竭型T 細(xì)胞，其細(xì)胞膜表面高表達(dá)PD-1、CTLA-4 等免疫抑制分子，不僅喪失了分泌IFN-γ等效應(yīng)因子的功能，而且還產(chǎn)生免疫抑制的作用。因此，運(yùn)用 PD-1/PD-L1 抗體可以靶向阻斷 PD-1/PD-L1 信號(hào)通路來增強(qiáng)T 細(xì)胞的應(yīng)答，以激活抗腫瘤免疫，調(diào)節(jié)臨床抗腫瘤活性[18]。

以往的研究觀點(diǎn)認(rèn)為PD-L1 主要存在于腫瘤組織細(xì)胞的細(xì)胞膜上，因此我們推斷其對(duì)T 細(xì)胞的抑制作用也主要局限于腫瘤微環(huán)境中。而最新的研究[19]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以通過釋放表面富含PD-L1 的外泌體發(fā)揮對(duì)腫瘤殺傷性T 細(xì)胞的功能抑制作用，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)第一次證實(shí)PD-L1 不僅存在于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上，還大量存在于腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體膜表面，且其含量比腫瘤細(xì)胞膜表面的PD-L1 高得多。外泌體是由細(xì)胞分泌產(chǎn)生的直徑在50-120 nm 的一類細(xì)胞外囊泡，攜帶豐富的生物活性分子(如蛋白質(zhì)、RNA 等)，并可通過自分泌或旁分泌方式參與對(duì)局部或遠(yuǎn)處細(xì)胞的功能調(diào)控，影響細(xì)胞外微環(huán)境[20]。研究人員在轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤患者及小鼠荷瘤動(dòng)物模型中證實(shí)，腫瘤細(xì)胞分泌的富含PD-L1 的外泌體可進(jìn)入機(jī)體并通過外周血對(duì)腫瘤微環(huán)境以外的T 細(xì)胞起抑制調(diào)控作用，且外周血中PD-L1 陽性外泌體的濃度水平與腫瘤大小有密切的正相關(guān)關(guān)系。此外，腫瘤細(xì)胞分泌的富含PD-L1 的外泌體還可進(jìn)入機(jī)體外周循環(huán)系統(tǒng)，并與其中的T 細(xì)胞接觸同時(shí)抑制其功能，達(dá)到全面抑制T 細(xì)胞抗癌免疫的作用，從而將PD-1/PD-L1 信號(hào)通路介導(dǎo)的腫瘤免疫抑制作用拓展到了全身范圍內(nèi)。本研究結(jié)果是對(duì)目前腫瘤免疫檢查點(diǎn)的抑制調(diào)控機(jī)制的重要補(bǔ)充，有助于研究者進(jìn)一步了解腫瘤免疫逃逸的機(jī)制。

以樹突狀細(xì)胞(DC)為基礎(chǔ)的癌癥免疫治療是最重要的抗癌免疫療法之一，對(duì)不同的癌癥類型有不同的療效。DC 細(xì)胞上PD-L1 的表達(dá)與T 細(xì)胞上的PD-1 相互作用，導(dǎo)致DC 細(xì)胞向T 細(xì)胞呈遞腫瘤抗原后的抗腫瘤反應(yīng)受到抑制。Hassannia等的研究結(jié)果表明[21]，DC 疫苗中PD-L1 的沉默可以影響其表型和功能特性，并增加T 細(xì)胞的激發(fā)潛能。此外，PD-1 沉默可以增強(qiáng)在PD-L1 沉默的DC 上識(shí)別腫瘤抗原后的T 細(xì)胞反應(yīng)。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)表明PD-L1 沉默的DC 疫苗與負(fù)載PD-1 小干擾RNA 的納米粒聯(lián)合治療癌癥具有很高的效力。

2.2 NK 細(xì)胞相關(guān)PD-1/PD-L1 檢查點(diǎn)通路

NK 細(xì)胞是除T 細(xì)胞和B 細(xì)胞以外的第三類重要淋巴細(xì)胞，它通過釋放細(xì)胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答。不僅是免疫系統(tǒng)的第一道防線，而且由于其具有識(shí)別應(yīng)激細(xì)胞分子模式的能力，也介導(dǎo)了抗實(shí)體瘤和血液腫瘤免疫反應(yīng)。NK 細(xì)胞在一些異基因干細(xì)胞移植中具有較強(qiáng)的抗白血病細(xì)胞活性，并且它們?cè)趯?shí)體瘤中的存在也是一個(gè)很好的預(yù)后因子。與T 細(xì)胞的識(shí)別機(jī)制不同，NK 細(xì)胞的識(shí)別并不要求癌細(xì)胞表達(dá)新抗原或過度表達(dá)自身相關(guān)抗原，腫瘤細(xì)胞上組織相容性復(fù)合體表達(dá)的缺失增加了腫瘤對(duì)NK 細(xì)胞殺傷的敏感性，并且NK 細(xì)胞通常被在致癌應(yīng)激時(shí)上調(diào)的配體激活[22]。

PD-1/PD-L1 通路抑制劑的最初設(shè)計(jì)原理主要是解除腫瘤微環(huán)境對(duì)T 淋巴細(xì)胞的耗竭，提高T 細(xì)胞的抗腫瘤效果。但在眾多的臨床試驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1 通路同樣參與了NK 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。在幾種癌癥適應(yīng)癥中的NK 細(xì)胞上已經(jīng)檢測(cè)到PD-1 的表達(dá)[23-25]。

目前發(fā)現(xiàn)在一些缺乏人類白細(xì)胞抗原-I 分子表達(dá)的腫瘤中，PD-1 拮抗劑仍有效；并且在一些腫瘤類型中觀察到了對(duì)PD-1 拮抗劑的強(qiáng)烈臨床反應(yīng)。Benson DM Jr 等人[26]在一項(xiàng)針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的免疫治療研究中發(fā)現(xiàn)患者的外周血NK 細(xì)胞過表達(dá)PD-1，提示患者NK 細(xì)胞的腫瘤殺傷功能可能受到PD-1/PD-L1 通路的抑制。而在隨后的抗PD-1 抗體治療研究中發(fā)現(xiàn)，被PD-1 抗體封閉的NK 細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷活性。這提示我們：在未來的研究中，確定導(dǎo)致腫瘤中NK細(xì)胞表達(dá)PD-1 的機(jī)制以及不同腫瘤中PD-1 表達(dá)差異的來源將是非常重要的。

關(guān)于PD-1 是否以及如何調(diào)節(jié)NK 細(xì)胞對(duì)腫瘤反應(yīng)的分子機(jī)制研究尚不明確。以前的一些研究表明，抑制性受體破壞了NK 細(xì)胞的穩(wěn)定性，使NK 細(xì)胞在成功發(fā)起溶細(xì)胞攻擊之前脫離了它的目標(biāo)[27,28]。另外一項(xiàng)研究結(jié)果表明[29]，PD-1 的參與抑制了NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，阻斷了NK 細(xì)胞免疫突觸的裂解顆粒極化，同時(shí)伴有整合素“由外向內(nèi)”信號(hào)的損傷。這些研究為PD-1 受體如何破壞NK 細(xì)胞功能提供了新的機(jī)制見解。

Hsu J 等人于2018 年9 月在國(guó)際醫(yī)學(xué)期刊《Journal of Clinical Investigation》上發(fā)表的文章[30]也闡明在小鼠腫瘤模型內(nèi)PD-1/PD-L1 抑制通路對(duì)NK 細(xì)胞起到了抑制作用。該研究表明，即使在體外NK 細(xì)胞靶標(biāo)較差的腫瘤中，也會(huì)出現(xiàn)NK 細(xì)胞表達(dá)PD-1 的情況。在表達(dá)NK 激活配體的RMA 轉(zhuǎn)染形成的腫瘤中，PD-1 的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，但并不明顯。這些數(shù)據(jù)表明PD-1 的表達(dá)是由腫瘤內(nèi)部提供的其他激活信號(hào)或激活信號(hào)的組合誘導(dǎo)的。這些研究提示我們可以將PD-1 或PD-L1 抗體治療與通過其他方式增強(qiáng)NK 細(xì)胞抗腫瘤效果的藥物聯(lián)合起來介導(dǎo)NK 細(xì)胞對(duì)癌癥的反應(yīng)。另一項(xiàng)研究[31]結(jié)果分析證實(shí)，NK 細(xì)胞對(duì)于免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的效果的確起到了十分重要的影響。研究人員在對(duì)人以及小鼠體內(nèi)的NK 細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞為PD-L1 陰性)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，PD-L1 陽性的NK 細(xì)胞，在遇到對(duì)其易感的腫瘤細(xì)胞后，能夠成功被激活，并且分泌出更多的細(xì)胞因子和溶細(xì)胞顆粒，最終增強(qiáng)免疫療法的抗癌效果。通過體外研究證實(shí)，PD-L1 陽性的NK 細(xì)胞與PD-L1 陰性、或者是未接觸腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞因子的NK 細(xì)胞相比，具有更強(qiáng)的殺滅腫瘤細(xì)胞的能力。這些發(fā)現(xiàn)同樣在動(dòng)物模型的體內(nèi)研究中得到了證實(shí)。不僅如此，這項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，PD-L1 陽性NK細(xì)胞的水平與癌癥患者的預(yù)后存在著明顯的相關(guān)。進(jìn)一步研究結(jié)果證實(shí)，在免疫檢查點(diǎn)抑制劑的作用下，PD-L1 陽性的NK細(xì)胞的殺傷作用會(huì)變得更強(qiáng)，不僅能夠直接殺死腫瘤細(xì)胞，還能通過分泌的細(xì)胞因子控制腫瘤的生長(zhǎng)。而在PD-L1 抗體的基礎(chǔ)上聯(lián)合NK 細(xì)胞活化因子，還能再一次顯著提高治療效果。最新研究結(jié)果也顯示[32]，PD-1 單抗聯(lián)合NK 細(xì)胞療法的治療效果是單純采用PD-1 單抗治療的近1 倍。實(shí)驗(yàn)組患者在采用PD-1 單抗聯(lián)合NK 細(xì)胞治療后，腫瘤最大橫向直徑顯著縮短；另外，聯(lián)合治療后，NK 細(xì)胞的數(shù)量增加顯著且在整個(gè)試驗(yàn)過程中治療耐受性良好，對(duì)癥治療后所有癥狀均緩解。這項(xiàng)研究結(jié)果表明，將抗PD-1 或抗PD-L1 抗體與NK 細(xì)胞聯(lián)合使用可增強(qiáng)抗腫瘤作用，為先前接受過PD-L1+晚期治療的非小細(xì)胞肺癌患者提供了全新的治療方案。Barry 等的研究[33]表明，NK細(xì)胞可通過DC 細(xì)胞增強(qiáng)PD-1 免疫療法的療效，這些先天細(xì)胞是增強(qiáng)T 細(xì)胞腫瘤反應(yīng)所必需的，這表明腫瘤微環(huán)境中NK細(xì)胞和DC 細(xì)胞水平也可以作為預(yù)測(cè)PD-1 抗體藥物療效的生物標(biāo)記物。

2.3 巨噬細(xì)胞相關(guān)PD-1/PD-L1 檢查點(diǎn)通路

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)是指腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞，根據(jù)活化途徑和分泌的細(xì)胞因子及表型分成經(jīng)典活化的M1 型和選擇性活化的M2 型巨噬細(xì)胞。M2 型TAMs 可以抑制腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫，并分泌促腫瘤產(chǎn)物，因此被認(rèn)為具有更重要的促腫瘤作用[34]。Chen 等[35]提出在腫瘤微環(huán)境中，TAMs 所產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子可通過NF-KB與STAT-3 信號(hào)通路促進(jìn)PD-L1 的表達(dá)。而根據(jù)以往的研究，PD-L1 的表達(dá)可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1 表型轉(zhuǎn)變[36]。腫瘤可通過在微環(huán)境中產(chǎn)生IL-10 和巨噬細(xì)胞集落刺激因子，誘導(dǎo)TAMs 過度表達(dá)，從而阻礙正?？乖蔬f和腫瘤免疫反應(yīng)[37]。此外，TAMs 分泌的表皮生長(zhǎng)因子能夠降低上皮鈣黏著蛋白、B-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平[38],使細(xì)胞黏附能力下降，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲、進(jìn)展和擴(kuò)散。

Gordon 等[34]的 研 究 表 明TAMs 表 達(dá)PD-1，提 示PD-1/PD-L1 信號(hào)通路可能通過直接作用于巨噬細(xì)胞而發(fā)揮作用。應(yīng)用PD-1/PD-L1 抗體可以阻斷其抑制作用，恢復(fù)巨噬細(xì)胞抗癌活性。這項(xiàng)研究進(jìn)一步提高了我們對(duì)阻斷PD-1 和PD-L1相互作用促進(jìn)抗腫瘤免疫機(jī)制的了解。也有研究[39]顯示，晚期胃癌衍生的外泌體也可以有效誘導(dǎo)PD1+AMs 的產(chǎn)生，并且這些細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的IL-10，從而抑制CD8+T 細(xì)胞免疫功能，為促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)創(chuàng)造條件。因此推測(cè)，可以通過聯(lián)合靶向PD1+TAMs 和腫瘤來源的外泌體的免疫治療方法來恢復(fù)腫瘤患者的免疫功能。

3 小結(jié)

腫瘤免疫治療和腫瘤微環(huán)境一直是研究的前沿，已取得了顯著進(jìn)展，特別是針對(duì)免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1 治療惡性腫瘤的研究。然而，大多數(shù)腫瘤的低反應(yīng)率仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。腫瘤微環(huán)境中多種成分之間相互作用、相互補(bǔ)充，其調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜。我們?nèi)孕柰七M(jìn)對(duì)腫瘤微環(huán)境的研究，探索新的治療靶點(diǎn)。以往的PD-1/PD-L1 抑制劑主要針對(duì)T 細(xì)胞，而隨著對(duì)PD-1/PD-L1 檢查點(diǎn)調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷加深，其他免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的PD-1/PD-L1 信號(hào)通路的相關(guān)調(diào)控機(jī)制也不斷被發(fā)現(xiàn)。因此，基于PD-1/PD-L1 抑制劑的治療方案也越來越多，如PD-1/PD-L1 單抗聯(lián)合NK 細(xì)胞、PD-1/PD-L1 單抗與通過其他方式增強(qiáng)NK 細(xì)胞抗腫瘤效果的藥物聯(lián)合、PD-1/PD-L1 單抗聯(lián)合靶向腫瘤來源的外泌體的免疫治療等方案。這些研究成果有望為腫瘤的臨床治療開辟新的策略。