楊芊，張玥，吳佳俊，潘艷芳

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

0 引言

哺乳動物的肝臟損傷后具有強(qiáng)大的再生能力，一方面是通過肝細(xì)胞的自我更新能力，另一方面便是通過肝卵圓細(xì)胞(hepatic oval cells,HOC)的增殖分化能力。即使切除三分之二的肝組織，數(shù)周之內(nèi)肝臟可再生并且恢復(fù)到其正常水平。是具有多向分化潛能的肝干細(xì)胞，在正常情況下，肝卵圓細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，不會在正常的成體肝組織內(nèi)檢測到，只要當(dāng)肝組織受到嚴(yán)重?fù)p傷時或者肝再生能力受到抑制時，肝卵圓細(xì)胞才會被激活，進(jìn)一步向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞進(jìn)行分化[1]。因此，肝卵圓細(xì)胞對于肝再生有著重大的作用。肝卵圓細(xì)胞在各種原因所導(dǎo)致的肝硬化，脂肪肝，肝癌等終末期肝性疾病的治療方面有著廣闊的發(fā)展前景，但是就目前形勢來看，肝卵圓細(xì)胞移植此方法僅在動物身上所做實驗較多，還沒有完全應(yīng)用于人類臨床。但是毋庸置疑的是，肝卵圓細(xì)胞無疑是肝移植的一個良好的細(xì)胞來源，未來的臨床前景是無限的。深入研究肝卵圓細(xì)胞的來源、特異性標(biāo)志物、在肝臟再生中的作用及潛在臨床應(yīng)用非常重要。然而目前研究對肝卵圓細(xì)胞的上述生物學(xué)特性仍然尚未完全闡明，這嚴(yán)重制約了肝卵圓細(xì)胞的應(yīng)用前景。本文對肝卵圓細(xì)胞的起源、標(biāo)志物、肝再生及臨床應(yīng)用前景進(jìn)行綜述，為該細(xì)胞在未來的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 肝卵圓細(xì)胞的來源

目前對肝卵圓細(xì)胞的存在已經(jīng)形成共識，但對其起源尚存在爭議，主要有以下5 種來源。分別為：(1)膽道上皮細(xì)胞；(2)胎兒肝中存在的祖細(xì)胞；(3)骨髓細(xì)胞；(4)肝星狀細(xì)胞；(5)成熟的成年肝細(xì)胞[2]。

1.1 來源于膽管上皮細(xì)胞

許多研究表明膽管上皮細(xì)胞在肝臟中起著兼職干細(xì)胞的作用。因此，這些分化的細(xì)胞可能會在特定條件下獲得干細(xì)胞樣特征[3]。最近的工作有證明了蛋白質(zhì)標(biāo)記物在探索肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate ceils，HSCs)的生理功能中的實用性。不幸的是，許多廣泛使用的標(biāo)志物，例如EPCAM(epithelial cell adhesion molecule EPCAM、CD133、Sox9、OPN(osteopontin OPN) 在 受 損肝臟的卵圓細(xì)胞和健康肝臟的膽管細(xì)胞和/或非實質(zhì)細(xì)胞中均被發(fā)現(xiàn)[4-5]。此外，據(jù)報道兼性HOC 表達(dá)CK19 和MIC1-1C3[5]。上述標(biāo)記的應(yīng)用由于缺乏細(xì)胞類型的特異性而受到限制。FoxI1 (Forkhead box I 1)，Trop2(encoded by tumor-associated calcium signal transducer 2 Trop2)、Lgr5 (1eucine—rich—repeat—containing G protein— coupled receptor 5)是三個的標(biāo)記，僅出現(xiàn)在受傷肝臟的卵圓細(xì)胞[6]。此外，F(xiàn)oxl1 +細(xì)胞和Trop2 +細(xì)胞表達(dá)EPCAM 和CK19 以及表達(dá)Lgr5 的類器官可以從培養(yǎng)中的膽管碎片中生長出來，進(jìn)一步支持了至少某些類型的肝卵圓細(xì)胞可以起源于自膽管細(xì)胞。此外，基因表達(dá)分析比較了Foxl1 + 的HOC、膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Foxl1 +的基因表達(dá)譜肝卵圓細(xì)胞類似于膽管細(xì)胞而不是肝細(xì)胞，從而支持肝卵圓細(xì)胞來源于膽管細(xì)胞[6]。

此外，許多報告表明，肝卵圓細(xì)胞的增殖隔室是與先前存在的小管相連。有趣的是，盡管在正常和受損肝臟中均發(fā)現(xiàn)了CD133 +細(xì)胞，但只有CD133 +細(xì)胞從受傷的肝臟中分離出來的病毒可以自我更新[7]。Kamiya 等人發(fā)現(xiàn)健康人體內(nèi)存在 “膽管細(xì)胞前體細(xì)胞”[8]。這些細(xì)胞在體內(nèi)可以表達(dá)CD13，體內(nèi)整合素α6(ITGA6 或CD49f)、CD133 和CK19。當(dāng)這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，它們可以自我更新，并開始表達(dá)肝卵圓細(xì)胞的標(biāo)記CD44 和肝細(xì)胞的標(biāo)記白蛋白。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了膽管細(xì)胞可以作為兼性肝卵圓細(xì)胞的前體。

1.2 胎兒肝中存在的祖細(xì)胞

肝母細(xì)胞是在胎兒肝臟中發(fā)現(xiàn)的雙能細(xì)胞(在小鼠中介于E9.5 和E14.5 之間)，具有在體內(nèi)分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的能力。由于肝母細(xì)胞和HOC 都有增殖能力，并能夠分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，因此認(rèn)為肝卵圓細(xì)胞起源于肝母肝細(xì)胞[9]。事實上胚母細(xì)胞和肝卵圓細(xì)胞具有相同的標(biāo)記物，例如δ樣1 同源物和甲胎蛋白(AFP)這些都是HOC 來源于肝母細(xì)胞的證據(jù)。胎兒細(xì)胞還具有肝卵圓細(xì)胞的其他特征，例如克隆形成性和體內(nèi)重新填充肝臟的能力。例如，鼠胎兒肝細(xì)胞的CD13 + DLK +的細(xì)胞具有在培養(yǎng)物中形成聚集的能力[10]，以及來自大鼠胎肝AFP + CK19 +的細(xì)胞具有在體內(nèi)再形成肝臟的能力[11]。大多數(shù)研究都沒有在健康的未損傷肝臟中觀察到CD13 + DLK +或AFP + CK19 +細(xì)胞的水平，這反駁了在成年器官中繼續(xù)存在胎兒成肝細(xì)胞。此外，成人肝臟中AFP 的表達(dá)不足以證明是來自胎兒肝母細(xì)胞的后代，這很可能是在成年兼性肝卵圓細(xì)胞中重新激活A(yù)FP 啟動子(或其他胎兒表達(dá)基因的啟動子)的情況。

1.3 來源于骨髓

在1999 年，Petersen 等人將雄性大鼠的骨髓移植到雌性大鼠中時，0.14%的肝細(xì)胞帶有Y 染色體[12]。他們還報道了骨髓來源的細(xì)胞能夠分化為肝細(xì)胞，盡管它們對肝實質(zhì)的貢獻(xiàn)程度不到1%。肝卵圓細(xì)胞和造血干細(xì)胞表達(dá)相同的標(biāo)記這一事實進(jìn)一步支持了肝卵圓細(xì)胞可能源自骨髓的假說，如Thy1，CD34、Kit。隨后，兩個獨立的小組移植了骨髓細(xì)胞，并在富馬酰乙酰乙酸水解酶(FAH)缺陷的小鼠肝臟中檢測到了供體來源的肝結(jié)節(jié)。然而，隨后證明源自移植骨髓細(xì)胞的FAH 陽性的肝細(xì)胞是細(xì)胞融合的結(jié)果，而不是骨髓細(xì)胞實際分化為肝卵圓細(xì)胞或肝細(xì)胞的結(jié)果[13]。為了解決這一差異，兩個獨立的研究小組分別移植了表達(dá)GFP 的骨髓細(xì)胞或lacZ 轉(zhuǎn)基因骨髓細(xì)胞，并證明當(dāng)受體小鼠遭受了CCl4，ANIT，DDC 或CDE 飲食介導(dǎo)的肝損傷，受體小鼠骨髓細(xì)胞在肝再生中的作用微不足道。同時也證明了骨髓細(xì)胞大鼠的肝卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞沒有幫助。2007 年，Piscaglia 等的研究證實，粒細(xì)胞集落刺激因子可以通過促進(jìn)骨髓來源的前體細(xì)胞遷移至肝臟從而參與肝組織的修復(fù)過程，并且粒細(xì)胞集落刺激因子能夠促進(jìn)肝卵圓細(xì)胞的激活和增殖[14]。但同時也有研究表明，骨髓來源的細(xì)胞可以遷移到肝臟，但并未分化為肝膽管細(xì)胞，肝細(xì)胞，肝卵圓細(xì)胞，也并未表達(dá)肝組織相關(guān)的抗原。由此可見，雖然骨髓來源的細(xì)胞在肝臟再生修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，但并未通過未分化的肝卵圓細(xì)胞發(fā)揮作用[15]。

1.4 來源于肝星狀細(xì)胞

肝星狀細(xì)胞是一種可分泌細(xì)胞外基質(zhì)的肝臟細(xì)胞，具有重要的生物功能。其靜息狀態(tài)時儲存有大量的類維生素A，存在于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞之間Disse 間隙內(nèi)，Disse 間隙具有干細(xì)胞小體的特點，激活后可分化為肌成纖維細(xì)胞，金額熱導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[16]。目前也有研究發(fā)現(xiàn)，它具有向間充質(zhì)干細(xì)胞的特征，體外培養(yǎng)過程中某一時段表達(dá)的基因與肝卵圓細(xì)胞類似，可以分化為成熟的肝細(xì)胞[17]。但是與此同時，也有研究發(fā)現(xiàn)，在肝損傷的小鼠的肝組織中，肝星狀細(xì)胞并不能分化為上皮細(xì)胞。因此，關(guān)于肝卵圓細(xì)胞是否來源于肝星狀細(xì)胞，還需要進(jìn)一步的研究。

最近的報告提出將肝星狀細(xì)胞作為一種肝卵圓細(xì)胞。這項研究是基于使用星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)通過Cre-loxP 技術(shù)進(jìn)行遺傳譜系追蹤。當(dāng)給小鼠喂食MCDE 飲食時，Gfap-Cre 標(biāo)記的細(xì)胞有助于肝卵圓細(xì)胞區(qū)室[18]。而使用的Gfap-Cre 驅(qū)動程序不僅在肝星狀細(xì)胞中活躍，而且在膽管細(xì)胞的一部分中也活躍。因此，作者無法排除在小鼠中觀察到的兼性HOC 由膽管細(xì)胞產(chǎn)生的可能性。實際上，Scholten 等人的后續(xù)研究表明星狀細(xì)胞不會對肝卵圓細(xì)胞區(qū)域起作用[19]。鑒于星狀細(xì)胞與肝細(xì)胞和膽汁細(xì)胞(分別來自中胚層和內(nèi)胚層)來自不同的胚芽層，因此星狀細(xì)胞進(jìn)入肝卵圓細(xì)胞可能需要太大的基因表達(dá)程序變化才能自然發(fā)生。

1.5 成熟的肝細(xì)胞

最近，Yanger 和Stanger[3]提出，肝細(xì)胞可以經(jīng)歷重編程為膽道譜系。他們將AAV8-TBG-Cre 注射到RosaYFP 小鼠體內(nèi)，以在成年肝臟中沿追蹤完全分化的肝細(xì)胞經(jīng)過DDC 處理后，出現(xiàn)了同時表達(dá)膽汁制造者A6 和肝細(xì)胞標(biāo)志物HNF4α的細(xì)胞。這些A6+HNF4α+細(xì)胞中有41%是雙核的，對YFP 的染色進(jìn)一步證實了這些細(xì)胞起源于肝細(xì)胞。他們鑒定出大量獲得膽道形態(tài)并表達(dá)OPN，A6，Sox9 或CK19 的YFP+細(xì)胞。他們還確定了在DDC 喂養(yǎng)的小鼠肝臟中的雙核HOC，但在對照小鼠的肝臟中沒有。這些結(jié)果表明，肝臟損傷時，肝細(xì)胞可以分化為膽管細(xì)胞和/或HOC。

2 肝卵圓細(xì)胞標(biāo)志物

肝卵圓細(xì)胞的標(biāo)志物在對其功能研究中具有重要意義。肝卵圓細(xì)胞處于膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞之間相互轉(zhuǎn)化過程的各個不同階段，但是肝卵圓細(xì)胞在損傷修復(fù)過程中的位置，表型及存在形式都飽受爭議。目前有研究試圖通過細(xì)胞表面標(biāo)志物對肝卵圓細(xì)胞進(jìn)行篩選區(qū)分，但尚未找到統(tǒng)一的表面標(biāo)志物，同時在研究中證實肝卵圓細(xì)胞并非來源于已分化成熟的肝細(xì)胞[20]。

肝臟的再生過程很復(fù)雜，是一個包括多種細(xì)胞增殖，由多條通路、多種因素共同參與的一種復(fù)雜而又精確的調(diào)控過程，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的突飛猛進(jìn)，近年來隨著對肝卵圓細(xì)胞研究的不斷深入，已經(jīng)確立了一些肝卵圓細(xì)胞高度表達(dá)的分子標(biāo)志物。依據(jù)其表達(dá)于細(xì)胞部位的不同，將其分為3 類：細(xì)胞膜類、細(xì)胞胞質(zhì)類、細(xì)胞胞核類。

(1)CD 分子類：CD 分子為細(xì)胞分化分子，在細(xì)胞分化增殖遷移中發(fā)揮重要的作用.在肝卵圓細(xì)胞增殖模型中，研究發(fā)現(xiàn)大量增殖的肝卵圓細(xì)胞表面表達(dá)多種CD 分子：CD24、CD44、CD90、CD133.CD24 是一種高度糖基化蛋白質(zhì)分子，與細(xì)胞黏附有關(guān)，CD24的表達(dá)參與了細(xì)胞的遷移，并調(diào)節(jié)細(xì)胞生長增殖[21]。

(2)受體類：在構(gòu)建大鼠肝損傷模型后，通過實驗觀察可發(fā)現(xiàn)，在肝臟再生修復(fù)的過程中，增殖的肝卵圓細(xì)胞可以表達(dá)多種受體，如：CTGF 受體、HGF 受體、SCF 受體、IFN 受體等。這些受體對肝卵圓細(xì)胞的增殖，分化起著重要的作用。

(3)大量增殖的肝卵圓細(xì)胞還表達(dá)分子：OV-1，間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志物：波形蛋白、內(nèi)皮蛋白、成骨蛋白7；Dorr el l 等應(yīng)用DDC( 1，4 二氫 3，5 吡啶二甲酸二乙酯)誘導(dǎo)的肝卵圓細(xì)胞增殖的模型中，發(fā)現(xiàn)大量增殖的肝卵圓細(xì)胞表達(dá)分子OC2-1 C6，OC2.2A6，OC2.6E10，同時，表達(dá)膽管上皮細(xì)胞分子標(biāo)志物：MIC1.1 C3，OC2.1 D11，OC2.2F3；這些在肝卵圓細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的多類型細(xì)胞標(biāo)志蛋白，為肝卵圓細(xì)胞多向性分化提供依據(jù)[22]。

盡管肝卵圓細(xì)胞表面標(biāo)志物很多，但是要尋找一個相對穩(wěn)定并且特異的肝卵圓細(xì)胞標(biāo)志物還具有一定的困難，需要我們進(jìn)一步的探索。

3 肝卵圓細(xì)胞與肝再生

在人類以及嚙齒動物的各種疾病中都發(fā)現(xiàn)了的HOC 的擴(kuò)增。但是，雖未得到證實，但HOC 對恢復(fù)肝實質(zhì)結(jié)構(gòu)和肝功能的貢獻(xiàn)已被假定[23]。到目前為止，已經(jīng)證明HOC 形成了管腔典型和非典型導(dǎo)管[24]，但尚不清楚這些導(dǎo)管是否功能齊全。雖然在培養(yǎng)細(xì)胞中形成管狀結(jié)構(gòu)已被用作HOC 分化為膽管細(xì)胞的能力的指標(biāo)[8]，但該測定法并未提供確定的證據(jù)支持HOC 衍生的膽管細(xì)胞已完全整合到膽道樹中?，F(xiàn)在仍缺乏支持內(nèi)源性HOC 在體內(nèi)形成功能性導(dǎo)管這一假說的確鑿證據(jù)。

直到最近，HOC 對肝細(xì)胞的貢獻(xiàn)也引起了爭論。使用Foxl1-Cre 進(jìn)行遺傳譜系追蹤；RosaLacZ 小鼠證明BDL 后2周，β-gal+/HNF4α+細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，表明Foxl1-Cre 標(biāo)記的HOC 可以形成新的肝細(xì)胞[25]。此外，在多種疾病模型(例如PH，DDC，BDL 和CCl4)中采用了腺相關(guān)病毒載體AAV8-Ttr-Cre 結(jié)合RosaYFP 小鼠進(jìn)行肝細(xì)胞命運追蹤[26]。作者發(fā)現(xiàn)了來自祖細(xì)胞的新形成的肝細(xì)胞細(xì)胞，盡管貢獻(xiàn)有限。同樣，另一組報道了2-AAF/PH 大鼠模型中存在稀有的CK19+或GSTP+ CK19-中間肝細(xì)胞[27]。在人類中，表達(dá)CK7 或也已經(jīng)觀察到CK19[28]。Sackett，Gao 等人證明了BDL 后Foxl1-/-小鼠的導(dǎo)管反應(yīng)受損與肝再生受損之間的相關(guān)性。在BDL 后14天，F(xiàn)oxl1-/-肝臟中CK19 +導(dǎo)管區(qū)域的擴(kuò)張減少，而對照肝臟則CK19+導(dǎo)管區(qū)域逐漸增加。與對照小鼠相比，F(xiàn)oxl1-/-小鼠中這種作用與血清AST 水平升高，肝細(xì)胞增殖延遲和實質(zhì)壞死增加有關(guān)。這些結(jié)果強(qiáng)烈支持HOC 有助于肝臟再生的觀點[25]。同樣，高瀨等證明，DDC 誘導(dǎo)的損傷后，成纖維細(xì)胞生長因子7(FGF7)的強(qiáng)制表達(dá)導(dǎo)致HOC 反應(yīng)增強(qiáng)，同時肝損傷和死亡率降低。在HPC 反應(yīng)期間肝臟中誘導(dǎo)產(chǎn)生的FGF7 可刺激HOC的增殖[23]。

與對照小鼠相比，F(xiàn)g f7 轉(zhuǎn)基因小鼠中A6+ CK19+ 肝卵圓細(xì)胞周圍新形成的A6+ CK19-肝細(xì)胞急劇增加。他們證明Fgf7 缺陷型小鼠的HOC 降低DDC 治療后血管擴(kuò)張，死亡和肝損傷更高[23]。在HOC 激活過程中ECM 沉積會阻止子代向薄壁組織擴(kuò)展和遷移。當(dāng)小鼠先接受CDE 飲食3 周，然后再進(jìn)行2 周減脂飲食時，與僅接受CDE 飲食的小鼠相比，iCreERT2 +HPC 顯著增加，這表明HOC 可能在恢復(fù)階段而不是疾病發(fā)展過程中發(fā)揮作用[29]。總而言之，HOC 會在損傷后促進(jìn)肝實質(zhì)增生，盡管在測試的實驗?zāi)Ｐ椭羞@樣做的貢獻(xiàn)可能很小，但擴(kuò)增的HOC 仍可能是治療肝病的目標(biāo)。

4 肝卵圓細(xì)胞的臨床應(yīng)用以及可能存在的問題

目前，對于治療終末期的肝臟疾病最有效的方法就是進(jìn)行肝移植。但是不是所有人都能承受高昂的費用以及肝移植后的副作用，而HOC 用于細(xì)胞治療是器官移植治療肝病的一種有吸引力的替代方法。首先，單個HOC 可以在培養(yǎng)物中擴(kuò)增而不會失去其雙向分化潛能[7]。其次，很多肝臟疾病中發(fā)現(xiàn)了HOC，表明HOC 可以是從患病肝臟中分離的。第三，有可能從患有肝病的患者中分離HOC，在培養(yǎng)中進(jìn)行擴(kuò)增，然后再移植回患者。這種自體移植方案將消除移植后的免疫抑制。最后，HOC 比肝細(xì)胞小，并且有人建議較小的細(xì)胞從門靜脈注射后較少出現(xiàn)門脈高壓[30]。但與此同時，肝卵圓細(xì)胞應(yīng)用于臨床也可能存在諸多問題。(1)肝卵圓細(xì)胞的分離與純化目前僅僅在動物模型上得到了進(jìn)展，尚未在人體上進(jìn)行。卵原細(xì)胞在人體中僅存在于肝臟和骨髓中，在人體中進(jìn)行肝卵圓細(xì)胞的分離與純化上有一定的風(fēng)險，目前，如何在人體中能夠安全有效的分離出卵原細(xì)胞以及如何調(diào)控肝卵圓細(xì)胞是目前研究的一個難點。(2)對于人體肝卵圓細(xì)胞的分離純化的操作還不太成熟，還需要慢慢摸索，同時對于肝卵圓細(xì)胞在人體中促進(jìn)肝臟再生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及傳導(dǎo)通路還需進(jìn)一步研究。(3)盡管有研究表明，肝卵圓細(xì)胞移植對于治療終末期的肝臟疾病有作用，應(yīng)用前景很光明，但是在應(yīng)用于臨床之前仍有很多的難題等待我們?nèi)ソ鉀Q[31]。

5 結(jié)論

肝卵圓細(xì)胞對于治療終末期肝臟疾病有很大的應(yīng)用前景，可以作為代替肝移植進(jìn)行肝臟疾病的治療的一種新型治療手段。但是，還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究來論證來自不同研究小組的不同結(jié)果，以期未來可以應(yīng)用于臨床。