張 萍 胡克特 陳榮祥 顧 丁
(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563000)
鹽膚木(Rhus chinensis)又稱五倍子樹,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)型樹種,兼具藥用、觀賞、工業(yè)、日用等價(jià)值,也可用于環(huán)境修復(fù),對(duì)多種重金屬尤其是鎘(Cd)具有較強(qiáng)的吸附性能[1-2]。鹽膚木葉片被癭綿蚜科(Pemphigidae)蚜蟲(Pemphigidae aphids)轉(zhuǎn)寄主寄生后而形成的蟲癭稱為五倍子,含有大量的單寧,是重要的資源昆蟲產(chǎn)物之一,有染色、解毒、消炎、抗菌的功效[3-4]。鹽膚木根部較為發(fā)達(dá),常用于治療胃腸道疾病和泌尿系統(tǒng)疾病,具有抗病毒、抗菌、止瀉、抗氧化、抗膽固醇等作用,具有潛在的預(yù)防和減輕酒精性脂肪肝的價(jià)值[5-6]。因此,鹽膚木是很多中成藥的組成部分[7-8]。我國(guó)的鹽膚木主要分布在貴州、陜西、四川、湖北等省份,因生長(zhǎng)環(huán)境的不同,鹽膚木根和五倍子的質(zhì)量也存在了一定的差異,并且多個(gè)研究表明不同地理因素可造成植物中成分含量的差異[9-10]。鹽膚木根與五倍子同為鹽膚木所產(chǎn)的中藥材產(chǎn)品,含有大量單寧及其衍生物,在目前的研究中關(guān)于五倍子的成分分析與藥理活性研究較多,而鹽膚木根卻少有人研究,且在藥用方面五倍子多用于中藥方劑與制劑,而鹽膚木根除作為中藥材入藥以外,還常被添加進(jìn)藥膳食用,并且二者的化學(xué)成分以及生理活性差異較大[5]。
植物的化學(xué)成分及其活性研究對(duì)于其資源開發(fā)和保護(hù)具有重要意義[11-12],鹽膚木根以及制劑中的化學(xué)成份有一定的研究,但多以沒食子酸含量為指標(biāo),采用高效液相色譜(HPLC)對(duì)鹽膚木的復(fù)方及單味藥制劑進(jìn)行含量測(cè)定研究[8]。然而,鹽膚木中具有生理活性的成分種類繁多,如酚酸、黃酮、三萜酸、多糖等[13-15]。其中酚類化合物的含量與種類尤其豐富,主要包括沒食子酸、苔黑酚及其衍生物如五沒食子酰葡萄糖、苔黑酚葡萄糖苷等[16]。因此,單獨(dú)以沒食子酸作為評(píng)價(jià)其質(zhì)量的指標(biāo),不足以令人信服。也有文獻(xiàn)采用分光光度對(duì)總酚酸的含量進(jìn)行測(cè)定,但是該方法無(wú)法對(duì)單個(gè)化合物進(jìn)行定量,也無(wú)法詳細(xì)評(píng)價(jià)地區(qū)間樣品的差異[17-19]。因此,以色譜法對(duì)鹽膚木中的主要化學(xué)成分進(jìn)行分離和檢測(cè)是評(píng)估其質(zhì)量的有效手段,然而鹽膚木中酚類化合物化學(xué)性質(zhì)接近,采用常規(guī)的液相色譜進(jìn)行分離耗時(shí)較長(zhǎng),時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本均較高,所檢測(cè)指標(biāo)一般較少[20],而超高效液相色譜(UPLC)較HPLC具有更高的分離度和靈敏度,通常采用亞2 μm填料色譜柱,可以縮短分析時(shí)間,提高分離效率,所以目前越來(lái)越廣泛用于天然產(chǎn)物成份分離[21]。例如李鷙等[22]采用超高效液相色譜對(duì)鹽膚木中的8種成分進(jìn)行了分離,并對(duì)福建、廣東和安徽等省份的鹽膚木進(jìn)行了測(cè)定。相對(duì)于光學(xué)檢測(cè)器,電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)靈敏度極高,同時(shí)具有良好的選擇性,在藥品和食品質(zhì)量控制方面發(fā)揮重要的作用,尤其適合檢測(cè)酚類[23]、硫醇和雜環(huán)類化合物[24]。由于其僅對(duì)具有電化學(xué)活性的化合物有響應(yīng),因此形成的色譜圖干擾較少,基線平穩(wěn)。酚類化合物具有較強(qiáng)的還原性,直流模式下較低的檢測(cè)電壓即可進(jìn)行檢測(cè),并且該條件下,糖類、有機(jī)酸、生物堿類均不干擾檢測(cè)[9]。因此,本研究以酚類化合物作為檢測(cè)指標(biāo),聯(lián)合UPLC與ECD用于鹽膚木根的成分分析,建立同時(shí)測(cè)定鹽膚木根中9種酚類化合物含量的方法,并對(duì)11批鹽膚木樣品進(jìn)行聚類分析與主成分分析,為各地鹽膚木根的品質(zhì)評(píng)估提供參考依據(jù),為該藥材指標(biāo)性成分的選擇、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和全面質(zhì)量控制提供參考,促進(jìn)全國(guó)鹽膚木產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。
鹽膚木根樣品采集自浙江、廣東、福建、貴州、廣西等11個(gè)地區(qū),用自來(lái)水清洗干凈,置于干燥箱50 ℃烘干,粉碎后過(guò)60目篩備用。
1.2.1 樣品溶液的制備
取處理好的樣品粉末,用電子天平(精確至0.1 mg)精確稱取0.1 g,加80%甲醇5 mL,超聲50 min,得到的萃取液取2 mL離心,上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)樣分析。
1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備
沒食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、表沒食子兒茶素、沒食子酸甲酯、苔黑酚、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸乙酯、表兒茶素沒食子酸酯、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖9種酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量,用甲醇溶解、定容,配制成1 mg/mL儲(chǔ)備液于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫褂们皩?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成所需濃度,標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2.3 UPLC測(cè)定鹽膚木根中酚類化合物的含量
采用UltiMate 3000 Bio-RS型超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司,美國(guó))進(jìn)行色譜分離。色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動(dòng)相條件為50 mmol/L檸檬酸鹽溶液(pH 2.9)與甲醇,按以下梯度程序洗脫:0~14 min,10%~35% 甲醇;之后采用40% 甲醇沖洗2 min后回到初始梯度并平衡4 min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣體積1 μL。3000 RS 電化學(xué)檢測(cè)器(賽默飛世爾科技有限公司,美國(guó))檢測(cè)電壓為600 mV,3400 RS 二極管陣列檢測(cè)器(賽默飛世爾科技有限公司,美國(guó))檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm。
1.2.4 測(cè)定方法驗(yàn)證
準(zhǔn)確移取不同體積的鹽膚木標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液(1 000 mg/L),加甲醇稀釋,分別配制濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液,按照優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行檢測(cè),以峰面積作為縱坐標(biāo),樣品濃度作為橫坐標(biāo),計(jì)算線性方程以及相關(guān)系數(shù)。
使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類分析、主成分分析和因子分析,將數(shù)據(jù)進(jìn)行分類、降維得出結(jié)果。
2.1.1 流動(dòng)相條件的優(yōu)化
因電化學(xué)檢測(cè)器必須在一定的緩沖鹽中運(yùn)行檢測(cè),而酸性環(huán)境有利于酚類化合物的分離。因此,以50 mmol/L檸檬酸鹽為緩沖溶液,由pH 7開始逐步降低其pH,當(dāng)pH下降到3以下時(shí),9種酚類化合物峰形良好,最終確定以50 mmol/L檸檬酸鹽(pH 2.9)-甲醇作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相檢測(cè)條件,進(jìn)行梯度洗脫。
2.1.2 檢測(cè)電壓的選擇
本實(shí)驗(yàn)前期將流動(dòng)相條件進(jìn)行了優(yōu)化,在此基礎(chǔ)上將檢測(cè)池的電壓由低到高以50 mV為間距,從0 mV升高至700 mV。將同一份樣品重復(fù)進(jìn)樣,考察由檢測(cè)電壓的變化引起的9種酚類化合物的響應(yīng)值的變化,以確定最佳的電壓檢測(cè)條件。由圖1可知,當(dāng)電壓低于600 mV時(shí),各成分的峰響應(yīng)值隨電壓增大而增大,600~650 mV趨于平緩且大部分酚類化合物在600 mV時(shí)響應(yīng)值最高,至650 mV以后,峰面積有下降趨勢(shì),而噪音快速增加。故選擇600 mV作為鹽膚木中各成份的檢測(cè)電壓。
圖1 不同檢測(cè)電壓下酚類化合物的響應(yīng)變化趨勢(shì)Fig.1 Trend of peak area of phenolic compounds under different potentional
2.2.1 方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證
9種酚類化合物線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999 0。以3倍信噪比計(jì)算檢測(cè)限,不同化合物的檢測(cè)限在1.8~16.9 μg/L之間,見表1。
表1 鹽膚木中9種酚類化合物線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Linear relationship of 9 phenolic compounds in R.chinensis
按優(yōu)化后的色譜條件對(duì)9種酚類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果表明9種酚類化合物的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.53%~0.84%,精密度良好。按試驗(yàn)方法對(duì)同一份樣品進(jìn)行分析,平行測(cè)定6次,峰面積的RSD為0.72%~3.07%,重復(fù)性良好。按試驗(yàn)方法對(duì)鹽膚木樣品進(jìn)行處理,4 ℃存儲(chǔ),分別于0、2、4、8、10、12 h進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明峰面積的RSD為1.03~2.16%,說(shuō)明樣品在4 ℃存儲(chǔ)具有較好的穩(wěn)定性。按試驗(yàn)方法對(duì)已知濃度樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)水平1∶1,重復(fù)5次,計(jì)算得出的9種酚類化合物的回收率為95.3%~102.1%,RSD小于5%,說(shuō)明本方法準(zhǔn)確可靠。
2.2.2 樣品含量檢測(cè)
將11個(gè)地區(qū)的鹽膚木樣品產(chǎn)地信息進(jìn)行記錄,如表2,采用優(yōu)化的提取條件和色譜條件對(duì)鹽膚木樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見表3。標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品的色譜圖見圖2。
表2 11個(gè)樣品產(chǎn)地地理信息匯總Table 2 Geographic information summary of 11 samples
表3 11批鹽膚木樣品中酚類化合物含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of phenolic compounds in the samples of R.chinensis from 11 regions mg/g
圖2 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of standard solution and sample
為了將11批鹽膚木樣品進(jìn)行歸類分析,使用軟件SPSS 24.0,采用系統(tǒng)聚類法,以組間聯(lián)接法為聚類方法,以平均歐式距離為聚類距離對(duì)11批省份的鹽膚木樣品進(jìn)行聚類分析(如圖3)。聚類 結(jié) 果 主 要 分 成3類:S2、S4、S10、S11為 第1類;S1、S5、S6、S7、S8、S9為第2類,S3為單獨(dú)一類。
將樣本聚類整理分析后,繼續(xù)使用SPSS 24.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件、以9種酚類化合物以及對(duì)應(yīng)的矩陣進(jìn)行主成分分析和因子分析。數(shù)據(jù)經(jīng)KMO(0.687)與巴特利特球型度檢驗(yàn)后確定適合進(jìn)行主成分分析,因此取特征值>1且統(tǒng)計(jì)顯著水平的數(shù)據(jù)作為主要成分,可將鹽膚木樣品的9種酚類化合物分為3個(gè)主要成分,如表4。利用得到的數(shù)據(jù)繪制散點(diǎn)圖,發(fā)現(xiàn)大部分樣本與主成分1較為靠近,見表5、圖4。
圖3 11批鹽膚木樣品中酚類化合物含量的聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis tree diagram of the samples of R.chinensis from 11 regions
表4 3個(gè)主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvalues and variance contribution rates of 3 principal components
表5 初始因子載荷矩陣Table 5 Loading factor of principal components
圖4 11批鹽膚木樣品中酚類化合物含量的PCA分析Fig.4 Principal component analysis of phenolic compounds in the samples of R.chinensis from 11 regions
鹽膚木中含有大量酚類化合物,多采用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)275 nm附近檢測(cè)[22]。將同一樣品在相同色譜條件下,將電化學(xué)檢測(cè)器和紫外線檢測(cè)器形成的的色譜圖進(jìn)行對(duì)比,圖5為樣品采用DAD檢測(cè)的色譜圖,樣品與圖2b為同一樣品,二者的色譜條件除檢測(cè)器外完全一致,可見電化學(xué)檢測(cè)的出峰效率和峰型狀態(tài)都比DAD檢測(cè)器好。電化學(xué)檢測(cè)器靈敏度高,快速準(zhǔn)確,更有利于鹽膚木各成份的分離檢測(cè)。
圖5 UPLC-DAD色譜圖Fig.5 Chromatogram of UPLC-DAD
鹽膚木生長(zhǎng)在在全年平均氣溫8~20 ℃,年降水量600 mm以上,質(zhì)地為沙壤、中壤,土壤pH值為微酸、微堿性的環(huán)境條件中。不同產(chǎn)地的鹽膚木因?yàn)榈乩憝h(huán)境的不同,酚類化合物的含量也有了差異。我們以酚類化合物作為指標(biāo),對(duì)11個(gè)地區(qū)的鹽膚木樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)S3、S10、S11樣本含量較高,分別含有18.944、11.362、10.178 mg/g。9種酚類化合物在11批鹽膚木樣本中的均值以沒食子酸最高,含有2.656 mg/g。主成分分析將樣品分成3個(gè)主要成分,主成分1的信息主要來(lái)自沒食子酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖,主成分2的信息主要來(lái)自苔黑酚葡萄糖苷、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯,主成分3的信息主要來(lái)自表沒食子兒茶素、苔黑酚,說(shuō)明樣品間的生長(zhǎng)習(xí)性和品質(zhì)有一定的相似性,這一結(jié)果對(duì)于鹽膚木根質(zhì)量的地區(qū)選擇與歸類有一定的參考依據(jù)。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC-ECD同時(shí)測(cè)定沒食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、表沒食子兒茶素、沒食子酸甲酯、苔黑酚、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸乙酯、表兒茶素沒食子酸酯、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖等9種酚類化合物含量的方法,并比較了11個(gè)地區(qū)鹽膚木樣品中9種酚類化合物的含量。該方法快速簡(jiǎn)便準(zhǔn)確,靈敏度高,重復(fù)性好,可為鹽膚木藥材藥理質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。