黎煒彬 嚴(yán)朝東 張 浩 蘇純蘭 陳葵仙 劉頌頌

（1.東莞市林業(yè)科學(xué)研究所，廣東 東莞 523000；2.香港園藝專業(yè)學(xué)會，香港 999077）

珍稀罕有的古樹名木，是我國林業(yè)資源的瑰寶，也是生物多樣性保護的重要組成部分[1]。古樹名木易受當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境、風(fēng)俗人情、歷史文化以及社會發(fā)展等因素影響。由于古樹樹齡大，樹勢較一般植株衰弱，抵抗病原菌侵害能力低下，往往存在空洞或枯木現(xiàn)象，故此，易被有害菌、如木材腐朽菌等侵染[2]。土傳性木材腐朽菌是導(dǎo)致木材腐朽病的主要病原菌之一[3]。盡管我國對林木土壤真菌多樣性的研究較廣泛，但主要集中于森林公園及各種植被比較豐富的自然保護區(qū)[4-8]，對于古樹名木根際土壤真菌群落組成與多樣性的報道卻極為匱乏。

植物根際真菌是土壤中重要的分解者，參與生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)、能量流動和信息傳遞[9-10]。土壤真菌在分解地表枯落物、礦化有機質(zhì)、提升土壤質(zhì)量和為植物根系提供營養(yǎng)等方面發(fā)揮著重要作用[11]。探究真菌在古樹名木根際土壤中的群落構(gòu)成及其多樣性特征，對古樹名木保護具有重要指導(dǎo)意義。近年來對古樹名木的土壤真菌多樣性研究以分離培養(yǎng)法為主，但該方法通常實驗周期長、準(zhǔn)確率不高、操作難度大，不能實現(xiàn)快速有效檢測與評價的目的[12]。古樹名木根際土壤真菌總量大，群落組成復(fù)雜，且較大部分的真菌難以通過上述方法分離，因此傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法并不能全面地反映土壤真菌群落的多樣性[13]。目前，關(guān)于微生物分類鑒定或系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究，主要的技術(shù)方案是內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）鑒定[14]。第2代基因測序技術(shù)具有通量大、時間短、成本低、讀取長度適中等優(yōu)點，與rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)相比，ITS具有更高的突變率，可以準(zhǔn)確地分類具有遺傳關(guān)系的菌株[15]，在環(huán)境生態(tài)[16-17]、醫(yī)學(xué)醫(yī)療等有關(guān)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

東莞市（22°39′～23°09′N，113°31′～114°15′E）地處廣東省中南部，珠江口東岸，東江下游的珠江三角洲，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫為23.1 ℃，年均日照時數(shù)為1 873.7 h，年降水量為1 800 mm以上，地帶性植被主要為熱帶季風(fēng)常綠闊葉林，是森林植物易繁衍的區(qū)域。古樹名木由于生長環(huán)境不同，健康狀況各異，可能會導(dǎo)致其土壤真菌的群落組成與多樣性有差異。本研究以東莞市3種長勢（正常、衰弱和瀕危）的古樹名木為對象，運用第2代高通量DNA測序技術(shù)（Illumina MiSeq平臺），探明上述3種長勢古樹名木根際土壤真菌的群落構(gòu)成與多樣性特點，旨在揭示古樹名木長勢和土壤真菌群落的關(guān)系，為古樹名木的健康預(yù)警和精準(zhǔn)保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 古樹名木調(diào)查與長勢評價

2019年初，對東莞全市古樹名木進行實地調(diào)查。研究對象為廣東省古樹名木信息管理系統(tǒng)（http://121.33.231.227:8070/）[18]中具有木腐病癥狀的古樹名木及其根際土壤。初步篩選出疑似患病古樹名木75株，其中散生54株，群生21株。1級古樹5株，2級古樹8株，3級古樹60株，名木2株，隸屬于24科46屬54種。疑患木腐病古樹名木以細(xì)葉榕（Ficus microcarpa）為主，占總株數(shù)40%，其余潺槁樹（Litsea glutinosa）、刺桐（Erythrina variegata）及土沉香（Aquilaria sinensis）等52種古樹名木每種僅有1～2株。據(jù)調(diào)查顯示[19]，上述古樹名木根際土壤包括赤紅壤、山地紅壤及山地黃壤等，土壤平均pH值為4.42。

長勢評價參考蘇純蘭等[20]的古樹健康狀況評價標(biāo)準(zhǔn)（表1），并根據(jù)調(diào)查情況作出修改，共設(shè)正常（ZC）、衰弱（SR）和瀕危（BW）3個長勢組，每個調(diào)查點采樣與評價面積為古樹名木的滴水面積。

表1 東莞市古樹名木長勢評價描述Table 1 Evaluation and description of growth potential of ancient and famous trees in Dongguan City

1.2 土壤樣品采集

基于對古樹名木的保護，本次取樣將采自大樹、古樹5～20 cm土層側(cè)根或須根系表面0.5～1 cm范圍內(nèi)的土壤視為根際土壤，每株疑似患病古樹隨機選取3～5個樣點，采集時用采樣鏟除去地表的雜物及洞口的大枝條和樹葉，多點采集的根際土壤充分混合后置于無菌自封袋中，合計75份土樣，以廣東省古樹統(tǒng)一編號命名并暫存于干冰泡沫箱內(nèi)，不設(shè)置重復(fù)。帶回實驗室后于4 ℃下保存，長期保存的土壤速凍后于-80 ℃保存。土壤預(yù)處理：土壤樣品先除去其中的石子和動植物殘體等異物、過20目標(biāo)準(zhǔn)篩（≤0.85 mm），儲存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總DNA提取與高通量測序

稱取0.5 g新鮮土樣，采用E.Z.N.A.?soil試劑盒（Omega Biotek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤微生物的總DNA，然后采用 Power Clean?DNA Clean-up Kit（MoBio，CA，USA）對提取的DNA進行純化，DNA濃度和純度利用 NanoDrop2000（Thermo，USA）進行檢測，再利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，最后放置–20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。對每份樣品，采用引物ITS3F/ITS4R（ITS3F∶5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′，ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增ITS片段[21]，PCR步驟按試劑盒說明書進行操作。使用2% 瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union-City CA，USA）進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用Quanti-Fluor?-ST（Promega，USA）對PCR產(chǎn)物進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE2*300的文庫。構(gòu)建文庫步驟：連接“Y”字形接頭；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR擴增進行文庫模板的富集；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中。

1.4 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

數(shù)據(jù)下機后，使用Trimmomatic軟件對原始測序序列進行質(zhì)控，使用FLASH軟件進行拼接：設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列；barcode需精確匹配，引物允許2個堿基的錯配，去除模糊堿基；根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，overlap需大于10 bp。去除無法拼接的序列。

使用UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根據(jù)97% 的相似度對序列進行分類單元（operational taxonomic units,OUT）聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Unite ITS 8.0數(shù)據(jù)庫，設(shè)置比對閾值為70%。使用I-sanger生信云系統(tǒng)，計算各樣本（組）共有或特有的OTU數(shù)量與α多樣性指數(shù)；基于UniFrac距離算法NMDS（non-metric multidimensional scaling）和ANOSIM（analysis of similarities）對各種長勢古樹名木根際土壤的真菌群落組成及β多樣性進行分析，通過對樣本（組）間距離判斷其差異大??；設(shè)置LDA（linear discriminant analysis）score的閾值為2，對各種長勢組的差異真菌進行分析，找出不同長勢中具有顯著性差異的真菌物種。本研究運用SPSS 24.0中單因素方差分析法判斷古樹名木不同長勢對其土壤真菌α多樣性指數(shù)的影響，運用最小顯著差異法（LSD）（P＜0.05）進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 古樹名木長勢

經(jīng)過長勢評價，正常組為48株，占總株數(shù)64.0%，其中古樹46株，名木2株；衰弱組為22株，占總株數(shù)29.3%；瀕危組為5株，占總株數(shù)6.7%。正常組古樹名木長勢較好，典型的癥狀出現(xiàn)在樹冠，異常葉片平均比例為15.3%，枯枝平均比例為7.5%，偶見枯枝掉落。衰弱組古樹出現(xiàn)一定范圍的損傷，異常葉片平均比例為43.8%，枯枝平均比例為27.5%，樹冠某處集中出現(xiàn)枯枝，樹干有明顯空洞。瀕危組古樹損傷嚴(yán)重，異常葉片平均比例為81.4%，枯枝平均比例為72.8%，樹木衰變，木材形成層活動減慢，樹冠稀疏，枯枝較多。

2.2 土樣測序結(jié)果

通過對古樹名木根際土壤真菌的ITS鑒定，75個土壤樣品一共獲得5 092 652條高品質(zhì)序列。供試土樣序列經(jīng)過OTU聚類處理，3個長勢組共有11 293個OTUs。所有土樣的稀釋曲線隨有效序列數(shù)目增加而逐漸平緩（圖1），說明本次取樣基本能反映真實環(huán)境，3個長勢組土壤真菌群落情況置信度較高。由圖2a的Venn圖可以看出，不同長勢古樹名木根際土壤中真菌OTU數(shù)目中，ZC獲得的OTU數(shù)目最多（9 486），其次是SR（6 911），BW最低（2 982）。3個長勢組土壤共有的OTU數(shù)目較多（2 195），同時在綱水平的Venn圖顯示（圖2b），3個長勢組樣點共有真菌45綱。

2.3 3種長勢古樹名木土壤真菌群落組成及物種差異

3種長勢75個土樣的OTU有效序列經(jīng)分析鑒定出17門、67綱、176目、418科、1 078屬、2 101種的真菌學(xué)名。由圖3可知，3個長勢組土壤真菌群落門水平上主要屬于9個類群，主要包括子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、分類地位未鑒定真菌（unclassified_k_Fungi）、被孢霉門（Mortierellomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、梳霉門（Kickxellomycota）和捕蟲霉門（Zoopagomycota）。

圖1 3個長勢組土樣稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of soil sample in 3 growing groups

圖2 3個長勢組土壤真菌韋恩圖Fig.2 Venn diagram of soil fungi in 3 growing groups

圖3 3種長勢古樹名木土壤真菌門水平上的群落豐度Fig.3 Community abundance at the level of phylum of soil fungi of 3 species of ancient and famous trees

由圖4可知，3個長勢組土壤真菌群落綱水平上主要屬于12個類群，主要包括糞殼菌綱（Sordariomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes）、分類地位未鑒定真菌（unclassified_k_Fungi）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、分類地位未鑒定子囊菌門真菌（unclassified_p_Ascomycota）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）、分類地位未鑒定羅茲菌門真菌（unclassified_p_Rozellomycota）、分類地位未鑒定羅茲菌亞門真菌（Rozellomycotina_cls_incertae_sedis）、盤菌綱（Pezizomycetes）和錘舌菌綱（Leotiomycetes）。

圖4 3種長勢古樹名木土壤真菌綱水平上的群落豐度Fig.4 Community abundance at the level of class of soil fungi of 3 species of ancient and famous trees

在屬分類水平上，忽略相對豐度小于1%的菌屬不計，3種長勢的古樹名木根際土壤真菌共有35屬（圖5）；各個長勢組均含有相當(dāng)一部分真菌未被分類，相對豐度在25%～35%。

圖5 3 種長勢古樹名木土壤真菌屬水平上的群落豐度Fig.5 Community abundance at the level of genus of soil fungi of 3 species of ancient and famous trees

根據(jù)LEfSe分析的LDA判別分值，由表2可知，在綱分類水平上，BW組土壤中糞殼菌綱與其他2個長勢組差異顯著。3個長勢組有顯著差異的真菌屬總計36個，其中BW組古樹名木土壤中差異顯著的真菌屬最多，共28個；ZC組與SR組有顯著差異的真菌屬數(shù)量相同，各有4個。

表2 3種長勢古樹名木土壤真菌門和屬的LDA分值（差異顯著）Table 2 LDA scores of soil fungi of 3 species of ancient and famous trees (significant difference)

2.4 3種長勢古樹名木土壤真菌群落多樣性分析

2.4.1 α多樣性分析

通過采用Chao1算法和Ace算法估算群落中OTU數(shù)目，反映土壤真菌群落物種豐富度；采用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)說明土壤真菌群落的多樣性。由表3可知，Chao指數(shù)和Ace指數(shù)由大到小排列依次為：SR＞BW＞ZC，其中SR的Ace指數(shù)與ZC差異顯著（P＜0.05）。各長勢組的香農(nóng)指數(shù)由大到小排列依次為：BW＞SR＞ZC，辛普森指數(shù)排序為：SR＞ZC＞BW，但差異均不顯著。

表3 不同長勢古樹名木土壤真菌生境內(nèi)多樣性指數(shù)（α多樣性指數(shù)）Table 3 Soil fungi within-habitat diversity index of ancient and famous trees with different growth potentials (α diversity index)

2.4.2 β多樣性分析

基于unweighted UniFrac距離算法，對3種長勢古樹名木土壤真菌群落OTU進行非度量多維尺度分析（NMDS分析），結(jié)果見圖6。3個長勢組的土壤真菌群落距離較近，ZC組范圍最大，基本包含其他2組的真菌群落，范圍大小關(guān)系為：ZC＞SR＞BW。為了檢驗群落組成結(jié)構(gòu)差異的顯著性，進行組間相似性分析（ANOSIM），結(jié)果表明3種長勢古樹名木土壤真菌群落OTU組成相似，且差異不顯著（R=-0.081，P=0.889）。

圖6 3種長勢古樹名木土壤真菌群落基于unweighted UniFrac距離的非度量多維尺度分析Fig.6 Non-metric multi-dimensional scale analysis of soil fungal communities of 3 species of ancient and famous trees based on unweighted UniFrac distance

3 結(jié)論與討論

Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)的發(fā)展為快速有效分析微生物群落結(jié)構(gòu)和組成提供了一個強大而高效的平臺[22]。部分學(xué)者指出，在不同的生境中，微生物群落的總體組成或許存在較大差異，但優(yōu)勢菌群基本相似[17]。結(jié)果表明：子囊菌門和擔(dān)子菌門是3種長勢古樹名木土壤真菌的優(yōu)勢菌門，其含量均高于70%。這2類菌在3個長勢組中豐度各異，其中子囊菌門在瀕危組中的相對豐度最高，正常組次之，衰弱組最低，在各組的含量分別為71.38%、59.68%及59.20%；擔(dān)子菌門在衰弱組的相對豐度最高，正常組次之，瀕危組最低，在各組的含量分別為26.15%、23.42%及17.01%。熊丹等[23]利用第2代基因測序技術(shù)（Illumina平臺）對貴陽市3個地區(qū)的馬尾松-杜鵑群落中杜鵑根圍土壤真菌群落分析，結(jié)果在調(diào)查區(qū)域中一共發(fā)現(xiàn)土壤真菌9門296屬，其中相對豐度最高的是子囊菌門和擔(dān)子菌門，這與本研究結(jié)果相一致。按屬水平分類，3種長勢古樹名木根際土壤中均含有部分真菌未被分類，在已分類的真菌屬中，豐富度由至高低排序分別為Saitozyma、曲霉屬（Aspergillus）、毛殼菌屬（Chaetomium）、被孢霉屬（Mortierella）、毛孢子菌屬（Trichosporon）、靈芝屬（Ganoderma）、青霉屬（Penicillium）、Apiotrichum、新赤殼屬（Neocosmospora）等，其中以Saitozyma、曲霉屬、毛殼菌屬、被孢霉屬、毛孢子菌屬、靈芝屬和青霉屬為優(yōu)勢菌屬。部分優(yōu)勢菌屬與相關(guān)研究結(jié)果一致，如董愛榮等[24]對紅松（Pinus koraiensis）林土壤真菌多樣性的研究指出，小興安嶺地區(qū)土壤真菌的優(yōu)勢屬為接合菌綱的被孢霉屬、子囊菌綱的青霉屬以及絲孢綱的木霉屬和輪枝孢屬（Verticilium）。賈麗等[25]對天水小隴山白皮松（Pinus bungeana）林的土壤真菌多樣性的研究表明，真菌的多樣性指數(shù)在不同樣地差異較大，優(yōu)勢菌群為子囊菌綱的青霉屬和子囊菌綱曲霉屬。

本研究對3個長勢組古樹名木根際土壤真菌生境內(nèi)多樣性（α指數(shù)）分析可知，受損古樹名木（衰弱組和瀕危組）根際土壤真菌群落豐度指數(shù)（Ace和Chao指數(shù)）大于健康的古樹名木（正常組）。不同的森林類型或植物種類[26]，其土壤微環(huán)境[27]或地表枯落物可利用率各異[28]，從而影響土壤真菌群落組成結(jié)構(gòu)。通過改變土壤環(huán)境[29]，植物使土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生分異，影響其物種多樣性[17,30]。對3種長勢古樹名木根際土壤真菌進行群落組成與多樣性分析，可以為古樹名木的管護和人工復(fù)壯提供科學(xué)依據(jù)。此外，3個長勢組土壤高通量測序結(jié)果顯示有大量真菌ITS序列未被鑒定，這些未知菌株尚待下一步的分析。

由結(jié)果可知，東莞市古樹名木大部分都有一定程度損傷，但總體長勢良好。3種長勢古樹名木根際土壤真菌群落以糞殼菌、傘菌和散囊菌3個菌綱為優(yōu)勢菌。結(jié)合土壤真菌OTU豐度與物種系統(tǒng)發(fā)育距離矩陣分析，3種長勢古樹名木土壤真菌群落組成無明顯差異。正常長勢組古樹名木長勢優(yōu)于衰弱長勢組和瀕危長勢組，導(dǎo)致土壤真菌群落豐富度低于衰弱長勢組和瀕危長勢組，古樹名木的長勢及健康狀況對其土壤真菌群落組成有一定影響。