孫秀秀 陳加利 楊立榮 云 勇 戚華沙 鄭道君

（海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶園藝研究所，海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南省熱帶特種經(jīng)濟(jì)植物種質(zhì)資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571100）

文昌錐（Castanopsis wenchangensis）俗稱“杠酸”“油酸”，屬殼斗科錐屬植物，是海南特有種，僅分布在海南島東北部的文昌少數(shù)地區(qū)。野外調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，文昌錐現(xiàn)存種群僅有8個(gè)，個(gè)體數(shù)量不超過1 000株且大部分為成年老樹，屬于海南特有極小種群，急需保護(hù)。文昌果實(shí)口感好，淀粉含量高（淀粉含量60%左右），營養(yǎng)價(jià)值豐富，是較好的淀粉植物，在海南北部，尤其是文昌和?？诘貐^(qū)，食用歷史悠久，市場銷價(jià)在30元/kg，具有較好的特色產(chǎn)品開發(fā)潛力。文昌錐分布地為沙地且干旱，屬常綠季雨林，該群落中還生長著許多地區(qū)特有錐屬植物，如海南島特有種海南錐、海南島文昌北部特有植物瓊北錐、波葉錐、平昌錐和毛果錐等極小種群[1-2]，生態(tài)環(huán)境較為脆弱。文昌錐耐干旱貧瘠，根系發(fā)達(dá)，樹木高大，是群落的優(yōu)勢(shì)種之一，對(duì)穩(wěn)定群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)環(huán)境有重要作用。系統(tǒng)研究文昌錐種群生態(tài)學(xué)、生殖生態(tài)學(xué)、保護(hù)遺傳學(xué)，對(duì)揭示文昌錐種群進(jìn)化歷史、有效保護(hù)該種群和種群恢復(fù)，以及穩(wěn)定脆弱的海南島東北部常綠季雨林生態(tài)具有重要意義，但目前還未見有文昌錐資源的研究報(bào)道。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）是2001年由Li和Quiros開發(fā)的一種新型PCR標(biāo)記技術(shù)。該標(biāo)記通過獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增開放閱讀框（ORFs）的特定區(qū)域，上游引物對(duì)外顯子進(jìn)行特異擴(kuò)增，下游引物對(duì)內(nèi)含子區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增，由于個(gè)體差異而產(chǎn)生多態(tài)性[3]。該標(biāo)記具有簡便高效、重復(fù)性好、易測序、多態(tài)性高等特點(diǎn)。目前已成功地應(yīng)用于植物種群遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析[4-7]、遺傳圖譜的構(gòu)建[8-9]、重要性狀的標(biāo)記[10]以及相關(guān)基因的克隆等方面[11]。但目前關(guān)于SRAP標(biāo)記應(yīng)用于殼斗科錐屬植物資源的研究較少。

本研究擬采用單因素與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法對(duì)影響文昌錐SRAP標(biāo)記反應(yīng)體系的因素進(jìn)行分析，率先優(yōu)化建立文昌錐SRAP反應(yīng)體系，篩選獲得有效SRAP引物，為SRAP標(biāo)記應(yīng)用于文昌錐種群進(jìn)化與保護(hù)遺傳學(xué)研究提供參考，也為其本地區(qū)特有錐植物極小種群的相關(guān)研究提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試材料為LFT-01、BC-02和BC-20，其中LFT-01采自海南省文昌市公坡鎮(zhèn)龍飛頭文昌錐居群，BC-02和BC-20采自海南省文昌市昌灑鎮(zhèn)寶彩村文昌錐居群。取健康葉片用硅膠干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

試驗(yàn)用的TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×TaqBuffer（含Mg2+）、100 bp DNA Ladder Marker由南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司提供，SRAP-PCR反應(yīng)引物采用Li和Quiros[3]設(shè)計(jì)的引物序列，由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

1.3 基因組DNA的提取

采用FOREGENE試劑盒提取文昌錐的葉片DNA。紫外分光光度計(jì)檢測基因組DNA的純度和濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質(zhì)量，將葉片所獲的基因組DNA樣品濃度稀釋到20 ng/μL備用。

1.4 SRAP-PCR反應(yīng)程序設(shè)置

反應(yīng)體系為20 μL，在PCR儀（Heal Force T960）上進(jìn)行。初始反應(yīng)為2×PCR buffer 2 μL，TaqDNA聚合酶2 U，dNTPs 0.25 mmol/L，引物濃度0.4 μmol/L和模板DNA 30 ng，用ddH2O補(bǔ)足到20 μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；然后在94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物放于4 ℃保存。

1.5 SRAP-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與建立

1.5.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以LFT-01基因組DNA為模板，選用引物組合Me8-Em2（Me8：TGAGTCCAAACCGGACC；Em2：GACTGCGTACGAATTTGC；退火溫度：54 ℃），對(duì)影響SRAP-PCR的主要因素（DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)（表1），保持其他因素不變的情況下變換一種因素進(jìn)行擴(kuò)增，篩選適宜的濃度范圍用于正交試驗(yàn)。

1.5.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選出DNA、引物、dNTPs和TaqDNA聚合酶4個(gè)主要影響因素的適宜的濃度范圍，進(jìn)行L16（45）方案的正交試驗(yàn)，確立最優(yōu)反應(yīng)體系。利用參照鄭道君等[12-13]的直觀分析法，根據(jù)擴(kuò)增條帶的清晰度和豐富度對(duì)每個(gè)組合的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行打分，最優(yōu)擴(kuò)增結(jié)果的為16分，最差的為1分。分別進(jìn)行2次獨(dú)立計(jì)分，取2次的平均數(shù)。進(jìn)行極差R值分析。

表1 SRAP-PCR單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 SRAP-PCR single factor test design

1.6 SRAP-PCR有效引物篩選和反應(yīng)體系驗(yàn)證

基于上述優(yōu)化建立的反應(yīng)條件，以LFT-01的基因組DNA為模板，對(duì)100對(duì)SRAP引物組合（正向引物10條，反向引物10條，正反引物相互組合成100對(duì)引物）進(jìn)行初選（表2），從中選擇擴(kuò)增3條以上產(chǎn)物的引物用于進(jìn)行多態(tài)性引物評(píng)價(jià)和反應(yīng)體系穩(wěn)定性驗(yàn)證。

表2 SRAP引物序列Table 2 Primer sequences used in SRAP analysis

基于上述優(yōu)化建立的反應(yīng)條件，以3份地理距離相差較遠(yuǎn)的文昌錐資源（LFT-01、BC-02、BC-20）的基因組DNA為模板，以多態(tài)性比率（PPB）為主要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)初選獲得的SRAP引物對(duì)進(jìn)行多態(tài)性引物評(píng)價(jià)，并進(jìn)行反應(yīng)體系穩(wěn)定性驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 DNA用量對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

研究結(jié)果表明，文昌錐基因組DNA的濃度對(duì)SRAP-PCR擴(kuò)增影響差異顯著。

圖1中，DNA用量為2.5～20 ng（泳道2～4）時(shí)擴(kuò)增條帶豐富且清晰穩(wěn)定，而后隨著DNA用量的增加，擴(kuò)增強(qiáng)度和擴(kuò)增條帶等擴(kuò)增效率方面逐漸下降，在7泳道和8泳道（DNA用量50 ng和60 ng）僅擴(kuò)增獲得1條400 bp的產(chǎn)物，在9泳道和10泳道（DNA用量80 ng和100 ng）沒有擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢姡牟F基因組DNA的用量越多，對(duì)SRAP反應(yīng)效率就越差。經(jīng)初選，確定2.5 ～20 ng為SRAP-PCR的適宜DNA濃度范圍，可用于正交試驗(yàn)。

2.1.2 引物濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

不同引物濃度對(duì)文昌錐SRAP-PCR反應(yīng)體系影響的結(jié)果如圖1所示。在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度范圍內(nèi)，隨著引物濃度的增加，擴(kuò)增產(chǎn)物從無到有，其中，濃度為0.025 μmol/L時(shí)無擴(kuò)增產(chǎn)物；當(dāng)引物濃度為0.05 μmol/L時(shí)僅擴(kuò)增一條大于1 500 bp的產(chǎn)物；最終在0.6 μmol/L及以上濃度（泳道17～20）時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，擴(kuò)增條帶多且條帶清晰。因此，選擇引物濃度范圍0.6～1.2 μmol/L做為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的適宜濃度。

圖1 DNA模板用量和引物濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響Fig.1 Effect of template DNA concentration and primer concentration on SRAP-PCR reaction system

2.1.3 dNTPs濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

dNTPs是PCR擴(kuò)增反應(yīng)的原料，其濃度直接影響PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物[14-16]。在本試驗(yàn)中，dNTPs濃度低于0.1 mmol/L及以下濃度時(shí)，擴(kuò)增效率嚴(yán)重不足（泳道1～3）。當(dāng)濃度在0.15～0.375 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，擴(kuò)增條帶多且主帶清晰；濃度等于0.5 mmol/L，擴(kuò)增條帶減少（泳道8）。之后沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。這可能是dNTPs濃度過高，影響了鎂離子與TaqDNA聚合酶的結(jié)合效率。這與鄭道君等[13]、歐虹雅等[16]的研究結(jié)果一致。可見，0.15～0.375 mmol/L范圍為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的dNTPs適宜濃度范圍。

2.1.4TaqDNA聚合酶濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

TaqDNA聚合酶的活性和用量對(duì)SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量的影響較大。由圖2可知，當(dāng)TaqDNA聚合酶濃度低于1 U，PCR反應(yīng)不完全，造成條帶模糊甚至沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；隨著酶用量的增加，擴(kuò)增條帶逐漸增多并清晰，尤其是TaqDNA聚合酶濃度在3 U時(shí)效果最好；當(dāng)高于5 U時(shí)，開始出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因此，選擇TaqDNA聚合酶2～5 U范圍用于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖2 dNTPs濃度和Taq酶濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響Fig.2 Effect of dNTPs concentration and Taq DNA polymerase on SRAP-PCR reaction system

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定適宜的的DNA濃度，引物濃度，dNTPs濃度和TaqDNA酶用量，用于文昌錐SRAP-PCR L16正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表3）。從擴(kuò)增的結(jié)果（圖3）看，不同濃度的因素組合對(duì)文昌錐SRAP-PCR影響顯著，有的擴(kuò)增失敗，有的擴(kuò)增效率低，條帶弱且少。

表3 SRAP-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 SRAP-PCR orthogonal test design

圖3 不同正交試驗(yàn)組合的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of diffferent orthogonal test combinations

根據(jù)條帶的清晰度、豐富度和條帶的強(qiáng)弱對(duì)每個(gè)組合的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行打分，16個(gè)組合的分?jǐn)?shù)依次為3，7，6，5，1，13，14，11，1，1，16，12，6，10，1，9。組合11的分?jǐn)?shù)最高，為最佳組合，其擴(kuò)增條帶總數(shù)為23條，其中包括強(qiáng)條帶13條和弱條帶10條；組合5，9，10和15無產(chǎn)物。因此，組合11是文昌錐SRAP的最佳反應(yīng)組合，即總體系為20 μL，DNA含量為20 ng，引物濃度為0.6 μmol/L，dNTPs濃度為0.15 mmol/L，TaqDNA聚合酶用量為4 U。

正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明（表4），DNA濃度，引物濃度，dNTPs濃度和TaqDNA聚合酶用量對(duì)文昌錐SRAP-PCR的擴(kuò)增影響程度不同。極差R值反應(yīng)了每個(gè)因素對(duì)PCR擴(kuò)增的影響程度，R值越大，影響越顯著。DNA，引物，dNTPs和TaqDNA聚合酶的R值分別為4.5，8，8，6.5，因此這4個(gè)因素對(duì)文昌錐SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響大小為：引物=dNTPs＞Taq酶＞DNA。

表4 正交設(shè)計(jì)結(jié)果直觀分析Table 4 Visual analysis of orthogonal design results

2.3 有效引物篩選及穩(wěn)定性檢驗(yàn)

采用已優(yōu)化的反應(yīng)體系，以LFT-01為模板，對(duì)100對(duì)SRAP引物進(jìn)行初選，最終獲得70對(duì)具有3條以上擴(kuò)增產(chǎn)物的SRAP引物。以3份地理距離相差較遠(yuǎn)的文昌錐資源（LFT-01、BC-02、BC-20）的基因組DNA為模板，對(duì)70對(duì)初選引物進(jìn)行多態(tài)性引物復(fù)選，以多態(tài)性百分率為主要標(biāo)準(zhǔn)（表5），獲得45對(duì)SRAP引物，擴(kuò)增結(jié)果如圖4。這45對(duì)引物，多態(tài)性百分率在50%～87%，其中Me4-Em5多態(tài)性最好。從圖4的擴(kuò)增效果看，基于最佳反應(yīng)體系，45對(duì)引物在3份文昌錐資源上的擴(kuò)增效果均較好，擴(kuò)增條帶清晰，主帶型穩(wěn)定，表明該體系穩(wěn)定可靠，可以應(yīng)用于文昌錐SRAP分析。

表5 經(jīng)過復(fù)選后獲得的45對(duì)SRAP引物組合擴(kuò)增信息分析及最佳退火溫度Table 5 Amplification information analysis and optimal annealing temperature of 45 pairs of SRAP primer combinations obtained after re-selection

圖4 經(jīng)過復(fù)選后獲得的45對(duì)SRAP引物組合擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification results of 45 pairs of SRAP primers obtained after re-selection

3 結(jié)論與討論

PCR反應(yīng)體系因植物材料的不同產(chǎn)生結(jié)果不同，DNA，引物，dNTPs、TaqDNA聚合酶均會(huì)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生影響。單因素試驗(yàn)是保持其他影響因素不變的情況下，改變單一因素，忽視了各因子之間的相互影響[17]。而正交試驗(yàn)不僅簡單高效，還考慮了各個(gè)因素之間的相互作用，已被廣泛應(yīng)用于PCR體系優(yōu)化[18-19]。本研究在分析明確DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶4個(gè)因子的單因素影響的基礎(chǔ)上，選擇適宜的濃度范圍用于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，為分析因素間的互交作用和確立最佳反應(yīng)體系組合奠定基礎(chǔ)。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，文昌錐的DNA濃度過高會(huì)嚴(yán)重阻礙到SRAP-PCR的擴(kuò)增效率，這與海南龍血樹（Dracaena cambodiana）[12]、鷓鴣茶（Mallotus furetianus）[19]、朱頂紅（Hippeastrum rutilum）[20]和紅楓（Acer palmatum）[21]等物種隨著DNA濃度提高對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響不大，可能是文昌錐葉片細(xì)胞內(nèi)含有TaqDNA聚合酶反應(yīng)效率的抑制性物質(zhì)較多引起，在以后的文昌錐PCR試驗(yàn)中要引起重視。

正交試驗(yàn)的直觀分析表明，在適宜的濃度范圍內(nèi)，對(duì)文昌錐SRAP-PCR影響最大的因子是引物和dNTPs，R值為8；影響最小的因子為DNA。這與在葛根（Puerariasp.）[22]和鷓鴣茶（Mallotus oblongifolius）[23]中的研究結(jié)果基本一致。劉燕等[15]在海雀稗（Paspalum vaginatum）SRAP-PCR的優(yōu)化體系試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)dNTPs最大的影響因子，最小的影響因子為Taq酶；李培等[24]對(duì)紅椿（Toona ciliata）進(jìn)行SRAP體系優(yōu)化時(shí)，影響最小的因子是DNA濃度，但影響最大的因子是TaqDNA聚合酶的濃度。由此可知，不同植物的SRAP-PCR中，不同因素的影響程度也不盡相同，這可能是由于不同的植物DNA特性，以及Taq酶的活力不同造成的。

本研究通過單因素和正交試驗(yàn)分析，率先獲得文昌錐SRAP-PCR最優(yōu)體系：在20 μL的總體系中，DNA含量為20 ng，引物濃度為0.6 μmol/L，dNTPs濃度為0.15 mmol/L，Taq DNA聚合酶的含量4 U。基于該反應(yīng)體系，從100對(duì)引物中篩選出45對(duì)能擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性好的引物組合。經(jīng)驗(yàn)證，該反應(yīng)體系具有較好的穩(wěn)定性，為SRAP分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于文昌錐，及其他殼斗科錐屬植物資源研究打下良好的基礎(chǔ)。