陳靖 張偉華 許晨

1天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院胰腺腫瘤科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心300060；2天津市人民醫(yī)院肛腸外科300191

0 引 言

根據(jù)美國2019年的統(tǒng)計結(jié)果，癌癥是除心血管疾病之外的導(dǎo)致人類死亡的第二主要原因。胰腺癌是目前公認(rèn)的惡性度最高、高度侵襲、進(jìn)展最快的癌癥之一，是目前人類因癌癥死亡的最主要原因[1]。胰腺癌的死亡率很高，僅在2019年，美國新發(fā)胰腺癌56 770 例，因胰腺癌死亡45 750 例[2]。大多數(shù)胰腺癌患者在確診時即為胰腺癌晚期，胰腺癌患者的5年生存率僅9%左右。胰腺癌主要分為兩種亞型，85%左右為胰腺腺癌，5%左右為胰腺內(nèi)分泌癌[3]。外科手術(shù)切除對于早期胰腺癌的治療具有明顯而獨(dú)特的優(yōu)勢，但由于胰腺癌進(jìn)展迅速且一般確診時就已出現(xiàn)晚期轉(zhuǎn)移，因此臨床上對大多數(shù)胰腺癌沒有效果明顯的治療措施[4]。近年來，由于醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，胰腺癌的診療已得到極大改善，通過在手術(shù)切除的基礎(chǔ)上，聯(lián)合化學(xué)治療、放射治療、生物治療和靶向治療，胰腺癌患者的5年生存率已經(jīng)得到明顯提升[5]。然而，目前仍缺乏用于胰腺癌早期診斷的兼具靈敏度和特異度的生物標(biāo)志物。

精子相關(guān)抗原5（sperm-associated antigen 5，SPAG5），位于17q11.2 染色體上，在細(xì)胞周期的M期上調(diào)，在細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[6]。SPAG5 通過與微管結(jié)合，可調(diào)節(jié)紡錘體組織的時間以及姐妹染色單體的分離。此外，SPAG5 還可通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路來保護(hù)細(xì)胞免受凋亡[7]。大量研究結(jié)果表明，SPAG5 參與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。Zhu 等[8]發(fā)現(xiàn)，SPAG5 作為推動乳腺癌進(jìn)展的相關(guān)癌基因，與疾病進(jìn)展和腫瘤惡性密切相關(guān)，SPAG5 有望作為乳腺癌的一個新的靶點(diǎn)。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)SPAG5 影響許多主要腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后，包括宮頸癌[9]、前列腺癌[10]、卵巢癌[11]等。例如，SPAG5 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)量比在正常肝臟組織中顯著增高，其通過PI3K/AKT 以及βcatenin 信號通路影響肝細(xì)胞癌的進(jìn)展和預(yù)后[12]。大量研究結(jié)果表明，SPAG5 可作為多種腫瘤診斷的生物標(biāo)志物以及治療的潛在生物靶點(diǎn)。但是，目前針對SPAG5 對于胰腺癌的臨床病理意義和功能的研究還不足，有待于進(jìn)一步深入研究。

本研究主要探索胰腺癌中SPAG5 的表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系，以便進(jìn)一步了解SPAG5 在胰腺癌中的作用，以期為胰腺癌的發(fā)現(xiàn)、監(jiān)測及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2013年1月至2018年12月，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)治療的胰腺癌患者94 例。其中，男性 52 例，女性 42 例，年齡 54.3 歲±13.2 歲。全部病例均經(jīng)過臨床病理證實(shí)，并具有完整的病例資料。收集患者的腫瘤組織標(biāo)本和相應(yīng)的癌旁正常組織樣本。根據(jù)AJCC-TNM-2010 分類系統(tǒng)和WHO/ISUP-2016 系統(tǒng)分別評估腫瘤分期和分級。本研究以1964年赫爾辛基宣言和隨后所有修訂案中規(guī)定的道德標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

Anti-Astrin/Deepest 抗體（ab197338，英國 Abcom公司），二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）（美國Cell Signaling Technology 公司）。

RM2235 型石蠟切片機(jī)（德國 Leica 公司），BX51 型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測

按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒的使用步驟進(jìn)行檢測。將石蠟標(biāo)本切成5 μm 薄片，65 ℃烤箱中烤片45 min，以便于脫蠟；將組織切片充分浸入二甲苯溶液中處理5 min，取出后再置于另一新的二甲苯溶液中繼續(xù)浸泡5 min，梯度乙醇溶液浸泡處理（100%、95%、85%、75%，各 5 min）；浸泡結(jié)束后，切片用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3 min，重復(fù)3 次；將切片置于枸櫞酸鹽緩沖液中，于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)（先高火加熱5 min 至沸騰后斷電，再次用中低火加熱8～10 min）；取出修復(fù)盒，于室溫下冷卻（保持玻片被修復(fù)液浸泡）；待1～2 h，液溫恢復(fù)常溫后，取出切片，以 PBS 洗滌 3 min，重復(fù)3 次；用濾紙擦干切片周邊多余的水分，在標(biāo)本上滴加過氧化物，并在濕盒中室溫孵育15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶；甩干多余液體后，用PBS洗滌3 min，重復(fù)3 次；甩干多余液體（不洗滌），滴加特異性一抗，涂布組織周圍均勻后置于濕盒中孵育，4 ℃冰箱內(nèi)過夜；次日取出濕盒并置于室溫下復(fù)溫；用PBS 洗滌5 min，重復(fù)3 次；濾紙擦干切片周邊多余水分后，在切片上滴加兔鼠通用IgG 二抗工作液，涂布均勻后置于濕盒中，在室溫下孵育25 min，取出濕盒，以PBS 洗滌3 min，重復(fù)3 次；滴加事先配制好的DAB 染色液，室溫顯色，并于顯微鏡下控制反應(yīng)時間（顯色時間5～8 min）；用自來水沖洗以終止染色，后用濾紙擦干切片周邊多余水分；在切片上滴加蘇木素染色液，復(fù)染細(xì)胞核，反應(yīng)時間平均為5～15 s；再次用自來水終止染色；將組織切片用梯度乙醇溶液處理（75%、10 s，85%、10 s，95%、10 s，100%、10 s，100%、5 min），然后將組織切片充分浸入二甲苯溶液中處理5 min，取出后再置于另一新的二甲苯溶液中繼續(xù)浸泡5 min。最后，用中性樹膠進(jìn)行封片，晾干，用光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像。

在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片顯色反應(yīng)，以細(xì)胞漿或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞必須滿足：細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；陽性顆粒定位性好；著色明顯高于背景。每張切片隨機(jī)選擇6 個以上的高倍鏡視野（×400），測量每個視野下陽性細(xì)胞的平均光密度值。

1.2.3 臨床樣本生物信息學(xué)分析

通過基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫獲取臨床樣本350 例，其中包括179 例胰腺癌組織樣本和171 例癌旁正常組織樣本。通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析SPAG5 的mRNA 在胰腺癌組織和癌旁正常組織中的差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組進(jìn)行比較時使用t 檢驗(yàn)，在定量分析時數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。用χ2分析探討臨床病理特征與蛋白表達(dá)的關(guān)系。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

結(jié)果表明，SPAG5 的mRNA 在胰腺癌組織中顯著高表達(dá)（P＜0.05）（圖1）。為了進(jìn)一步證明SPAG5在胰腺癌進(jìn)展演變中發(fā)揮的作用，利用Kaplan-Meier 分析SPAG5 與胰腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果表明，SPAG5 表達(dá)較低的患者中，總生存率和無病生存率都較高（圖2A 和圖2B）。上述結(jié)果提示，SPAG5 在胰腺癌組織中的表達(dá)水平偏高，并與胰腺癌患者的預(yù)后生存期相關(guān)。

圖1 胰腺癌中精子相關(guān)抗原5（SPAG5）的mRNA 表達(dá)

圖2 精子相關(guān)抗原5（SPAG5）表達(dá)與胰腺癌患者生存率的相關(guān)性

2.2 SPAG5 在常見腫瘤中的表達(dá)

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，SPAG5 在大多數(shù)腫瘤中表達(dá)量較高，其中在肝細(xì)胞癌和乳腺癌等腫瘤中表達(dá)非常顯著，而在非霍奇金淋巴瘤、腎癌以及泌尿系統(tǒng)腫瘤中低表達(dá)（圖3）。因此，進(jìn)一步在線分析了SPAG5 蛋白在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌以及肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，SPAG5在肝細(xì)胞癌中顯著高表達(dá)，且SPAG5 主要在胞漿著色（圖 4）。

圖3 精子相關(guān)抗原5（SPAG5）在常見腫瘤中的表達(dá)情況

2.3 SPAG5 蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性

為了探究SPAG5 在胰腺癌的進(jìn)展中的角色，本研究中，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測94 例胰腺癌組織中的SPAG5 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，SPAG5 主要定位于細(xì)胞質(zhì)，其表達(dá)量在胰腺癌組織中明顯高于癌旁正常組織（圖5）。根據(jù)染色的強(qiáng)度，將胰腺癌患者分為SPAG5 高表達(dá)組和SPAG5 低表達(dá)組（圖5A）。分組后發(fā)現(xiàn)，SPAG5 在癌旁正常組織中的表達(dá)量顯著降低（圖5B）。上述結(jié)果提示，SPAG5 與胰腺癌的進(jìn)展明顯相關(guān)。

2.4 SPAG5 蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性

為了闡明SPAG5 在胰腺癌進(jìn)展中的作用，分析比較了SPAG5 高表達(dá)組和SPAG5 低表達(dá)組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。分析結(jié)果表明，SPAG5在胰腺癌組織中的高表達(dá)與腫瘤分期（P=0.034）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.024）和腫瘤尺寸（P=0.012）明顯相關(guān)，而與性別、年齡以及腫瘤分級無關(guān)（均P＞0.05）。（表 1）

2.5 SPAG5 作為胰腺癌潛在生物標(biāo)記物分析

圖4 精子相關(guān)抗原5（SPAG5）在幾種常見腫瘤中的免疫組化染色圖片（×200）

圖5 胰腺癌組織和癌旁正常組織中精子相關(guān)抗原5（SPAG5）的免疫組化染色圖片

上述結(jié)果提示，SPAG5 可能是胰腺癌的一種潛在預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)記物。因此，對SPAG5 作為腎癌、肝細(xì)胞癌及胰腺癌的預(yù)后標(biāo)記物的可行性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，SPAG5 在3 種腫瘤中均可發(fā)揮顯著的預(yù)后生物標(biāo)記物作用（均P＜0.001）。且在胰腺癌中更加明顯（P＜0.001）（圖 6）。該結(jié)果提示，SPAG5有望作為一個潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物以及新的靶向治療靶點(diǎn)。

表1 精子相關(guān)抗原5（SPAG5）蛋白表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

圖6 精子相關(guān)抗原5（SPAG5）作為腎癌、肝細(xì)胞癌以及胰腺癌的預(yù)后標(biāo)志物可能性的分析

3 討論與結(jié)論

胰腺癌是一種是一種嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤，其患者的中位生存期一般不超過1年。誘發(fā)胰腺癌的危險因素有很多，其中吸煙是所有危險因素中最嚴(yán)重的，因?yàn)闊煵葜械闹掳┪镔|(zhì)很容易通過血液到達(dá)胰腺[13]。雖然，胰腺癌的診療技術(shù)已經(jīng)得到飛速的進(jìn)步，但胰腺癌患者的中位生存期仍然很短。手術(shù)切除是治療早期胰腺癌的唯一有效手段，但大多數(shù)胰腺癌患者初次診斷時即為晚期，缺乏手術(shù)時機(jī)。雖然，在化療、放療、免疫治療以及靶向治療的聯(lián)合作用下，胰腺癌患者的預(yù)后已得到極大改善[14]，但是臨床上仍缺乏有效且靈敏的生物標(biāo)記物，無法在胰腺癌早期就對其發(fā)現(xiàn)并予以切除。大量研究結(jié)果表明，SPAG5 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了巨大作用。SPAG5 是17q11.2 擴(kuò)增的一個新的生物標(biāo)志物，在宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌以及前列腺癌、肝細(xì)胞癌中明顯高表達(dá)[15]，并且SPAG5 的高表達(dá)與這些腫瘤的臨床預(yù)后顯著相關(guān)。Salemi 等[16]發(fā)現(xiàn)SPAG5 在唐氏綜合征患者的外周血白細(xì)胞中明顯高表達(dá)，說明SPAG5 可能在很多非腫瘤疾病中也發(fā)揮了重要作用。

本研究中，基于GEPIA 數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果表明，SPAG5 在胰腺癌中的表達(dá)量明顯高于正常胰腺組織，且SPAG5 表達(dá)量高的胰腺癌患者的無病生存率和總生存率都比較低。該結(jié)果與其他研究者在其他腫瘤上得出的結(jié)論是相符的。為了更加鞏固上述結(jié)論，本研究中對收集到的94 例胰腺癌組織進(jìn)行了免疫組化染色。結(jié)果顯示，SPAG5 在胰腺癌組織中的表達(dá)量明顯高于正常胰腺組織，將上述94 例胰腺癌組織切片根據(jù)染色強(qiáng)度分成高、低表達(dá)組，結(jié)果表明SPAG5 在胰腺癌組織中的表達(dá)情況與腫瘤的TNM 分期、腫瘤尺寸及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與年齡、性別和腫瘤分級無關(guān)，進(jìn)一步說明SPAG5 參與了胰腺癌的預(yù)后進(jìn)展。此外，SPAG5 在胃癌[17]和膀胱癌[18]中也明顯高表達(dá)并影響預(yù)后。

大量研究結(jié)果可以初步證實(shí)SPAG5 在胰腺癌中的重要作用，為深層次研究其與胰腺癌之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。綜上所述，可以初步認(rèn)為SPAG5 可作為胰腺癌的潛在生物標(biāo)志物以及靶向治療的靶點(diǎn)。由于本研究是單中心小樣本研究，未來需要擴(kuò)大樣本量并將研究重點(diǎn)放在探究SPAG5 與胰腺癌間的更深層次關(guān)系上，將通過基因操作技術(shù)構(gòu)建SPAG5表達(dá)載體，通過過表達(dá)或者敲除操作來改變其表達(dá)量，進(jìn)而觀察胰腺癌細(xì)胞的功能學(xué)行為改變，并構(gòu)建小鼠模型進(jìn)一步驗(yàn)證SPAG5 對胰腺癌的影響，以期揭示SPAG5 對于胰腺癌的具體作用機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突