王春妍 曹宇 郭遠強 趙黎莉 馮雪 文君 李嘉

肝衰竭為臨床常見的嚴重肝臟疾病，死亡率高。近年諸多研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)改變與肝衰竭發(fā)生發(fā)展密切相關。故此，本研究應用硫代乙酰胺造成急性肝損傷大鼠模型，應用高通量測序法分析急性肝損傷大鼠腸道菌群情況，了解大鼠腸道菌群結構、豐度與多樣性的變化。

資料與方法

一、材料

(一)實驗動物 選取SD雄性大鼠共16只，重230～250 g，清潔級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。許可證號SCKK(京)2014-0004。

(二)實驗試劑 硫代乙酰胺，購自天津市福晨化學試劑廠。

二、方法

(一)模型的制備及獲取 16只SD大鼠隨機分為造模組及正常對照組，造模組10只，對照組6只。予以皮下注射硫代乙酰胺(TAA)600 mg/kg造模急性肝損傷模型，正常對照組大鼠給予同等劑量生理鹽水皮注，48 h后造模完成。大鼠經(jīng)麻醉后，留取回腸糞便進行腸道菌群16S rDNA測序分析。

(二)腸道菌群分析 處死大鼠后,留取回腸糞便,應用糞便DNA提取試劑盒提取糞便細菌基因組DNA，利用引物設計軟件對各個細菌的引物進行設計。高通量測序文庫的構建和基于 Illumina MiSeq 平臺的測序由 GENEWIZ 公司(蘇州, 中國)完成。應用 Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA) 檢測 DNA 樣品的濃度，使用 MetaVxTM文庫構建試劑盒 (GENEWIZ, Inc., South Plainfield, NJ, USA)構建測序文庫。

以30～50 ng DNA 為模板，使用金唯智設計的一系列 PCR 引物擴增原核生物 16S rDNA 上包括 V3 及 V4 的 2 個高度可變區(qū)。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAA-TCC”序列的下游引物擴增 V3 和 V4 區(qū)。另外，通過 PCR 向 16S rDNA 的 PCR 產(chǎn)物末端加上帶有 Index 的接頭，以便進行 NGS 測序。 使用Agilent 2100 生物分析儀 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)檢測文庫質(zhì)量，并且通過 Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA)檢測文庫濃度。DNA 文庫混合后，按 Illumina MiSeq(Illumina, San Diego, CA, USA)儀器使用說明書進行 PE250/300 雙端測序(具體平臺以合同為準)，由 MiSeq 自帶的 MiSeq Control Software (MCS)讀取序列信息。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、大鼠一般狀態(tài)觀察

造模組大鼠48 h造模完成，死亡1只，其余大鼠處死前均有不同程度的精神萎靡，反應遲鈍，進食活動減少及中毒性鼓腸。對照組大鼠進食活動正常，精神狀況好。

二、肝臟組織病理學結果

造模組大鼠肝組織呈灶狀及片狀壞死，大量炎癥細胞浸潤，肝竇結構破壞，急性肝損傷造模成功；對照組大鼠肝細胞排列整齊，肝竇結構清楚，未見明顯炎癥細胞浸潤。

三、腸道細菌多樣性分析

通過ACE指數(shù)和 Chaol指數(shù)評估兩組樣本菌群豐度；通過Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評估兩組樣品菌群多樣性。結果顯示，造模組Chaol指數(shù)與對照組相比，有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)及ACE指數(shù)分析，結果顯示造模組上述指數(shù)與對照組相比有差異，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

四、微生物群落結構分析

(一)門分類等級細菌分布情況 在門水平上，兩組大鼠糞便中均有9個平均相對豐度都不低于1%的優(yōu)勢菌門：厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、疣微菌門、脫鐵桿菌門、軟皮菌類、細菌菌類及藍藻菌門。兩組的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門，造模組中依次占61.25%、32.48%，對照組分別占72.50%、25.80%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；其次豐度較高的門包括變形菌門、疣微菌門，造模組分別占2.91% 和2.73% ，對照組中分別占0.59%和0.63%。腸道菌群構成差異分析，造模組變形菌門、疣微菌門菌群與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

(二)屬分類等級細菌分布情況 在屬水平上，造模組中豐度由高到低依次是：毛螺旋菌屬13.59%、擬桿菌屬10.74%、木虱科8.50%、阿克曼屬 2.74%，對照組豐度由高到低依次是：毛螺旋菌屬13.84%、乳桿菌屬13.55%、木虱科10.74%、反芻球菌科4.55%。腸道菌群構成差異分析，造模組埃希菌屬、阿克曼屬、羅馬尼亞梭菌屬、真菌屬及嚴格梭菌屬豐度均高于對照組(P<0.05)，乳桿菌屬豐度低于對照組(P<0.05)，見表3。

討 論

目前研究已證實腸道菌群與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關。腸-肝軸在肝臟疾病治療中越來越受到重視[1]。

表1 腸道細菌多樣性分析

表2 門分類等級腸道菌群構成差異分析

表3 屬分類等級腸道菌群構成差異分析

本研究旨在應用高通量測序技術探討硫代乙酰胺所致急性肝損傷大鼠腸道菌群的變化。本研究證實，硫代乙酰胺可造成大鼠急性肝損傷模型。既往研究表明，硫代乙酰胺造成急性肝損傷模型，在急性肝損傷時出現(xiàn)明顯的腸道菌群失調(diào)[2]，但此研究所用的傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)鑒定方法存在一定局限性，故此本研究進一步應用高通量測序技術測定腸道菌群全基因組，并對急性肝損傷大鼠腸道菌群的各菌種相對豐度、多樣性及菌群結構進行深度分析。

本研究選取了菌群富集的回腸，對大鼠腸道菌群16S V3-V4區(qū)進行高通量測序。結果顯示造模組Shannon指數(shù)、Simpson 指數(shù)及ACE指數(shù)均顯著高于對照組，提示急性肝損傷組大鼠小腸菌群的豐度及多樣性均有升高，存在小腸細菌過度生長[3]。小腸細菌過度生長在肝臟疾病中廣泛存在，并與其嚴重程度密切相關[4-5]。

本研究中，在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門兩者之和占90%以上，屬于優(yōu)勢菌群。厚壁菌門和擬桿菌門的比例被稱為F/B比率，可用于評估是否存在腸道菌群失調(diào)[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模組大鼠F/B比率低于對照組大鼠(P<0.05)，提示造模組大鼠存在腸道菌群紊亂。

變形菌門包含了諸多機會致病菌及病原菌，多為革蘭陰性桿菌，產(chǎn)生脂多糖，造成腸源性內(nèi)毒素血癥，進而加重肝臟損傷。本研究提示：造模組變形菌門、變形菌門中具有代表性的埃希菌屬，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示變形菌門在急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定作用。

在屬水平上，腸道菌群構成差異分析，造模組埃希菌屬、阿克曼屬、羅馬尼亞梭菌屬、真菌屬及嚴格梭菌屬豐度均高于對照組(P<0.05)，乳桿菌屬豐度低于對照組(P<0.05)，提示造模組大鼠腸道內(nèi)出現(xiàn)埃希菌屬增加及乳酸桿菌的消耗。埃希菌屬豐度增高，對黏膜的侵襲性增強，誘導巨噬細胞產(chǎn)生并復制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，加重肝臟損傷。

研究表明，乳桿菌科可抑制腸道病原菌生長及定殖，改善腸道菌群結構，營養(yǎng)腸道黏膜，從而發(fā)揮顯著的益生效果[8-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，屬水平腸道菌群構成差異分析提示乳桿菌屬豐度明顯下降，其合成乳酸和短鏈脂肪酸減少，從而抑制腸道上皮細胞再生，抗炎能力下降，加重肝臟損傷。提示在急性肝損傷治療中，通過微生態(tài)制劑的補充有助于改善腸道菌群構成，減輕肝臟損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)在急性肝損傷中乳桿菌科豐度下降，故此，擬進一步研究乳桿菌科在肝功能衰竭時對功能組學及代謝組學影響，深入探討臨床合理應用益生菌的依據(jù)。