張玉杰，柏祥娥，肖水清，楊世茂(通訊作者)

(1.濟(jì)南市口腔醫(yī)院,山東 濟(jì)南；2.山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,山東 濟(jì)南)

0 引言

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周炎，尤其是慢性牙周炎病變區(qū)或活動部位最主要的優(yōu)勢菌[1]，含有多種毒力因子，具有顯著的毒力和致病性。細(xì)菌的致病性是某一個(gè)或幾個(gè)致病因子發(fā)揮決定作用的結(jié)果。致病島(Pathogen icity island)的發(fā)現(xiàn)和研究對了解細(xì)菌致病性具有重要的意義[2]，目前，Rag 位點(diǎn)被確定為P.gingivalis 致病島基因之一，該位點(diǎn)主要含有RagA、RagB，分別編碼RagA和RagB 蛋白。rag 蛋白構(gòu)成膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，協(xié)助細(xì)菌從外部環(huán)境獲取轉(zhuǎn)運(yùn)大分子，有助于細(xì)菌的存活和散播；同時(shí)Rag 蛋白還能夠激活宿主的免疫及炎癥反應(yīng)[3]。研究表明，Rag 位點(diǎn)在臨床菌株中有4 種不同的基因型[4-5]，分別命名為Rag-1、Rag-2、Rag-3 和Rag-4，不同rag 基因型P.gingivalis 致病能力亦不同。本研究采用多重PCR 技術(shù)檢測不同Rag 基因型P.gingivalis 在青少年牙齦炎患者中的分布，探討致病島Rag基因?qū)η嗌倌暄例l炎發(fā)生發(fā)展的影響。

1 資料與方法

1.1 材料

P.gingivalis ATCC33277 菌株、具核梭桿菌F.nucleatum ATCC25586 菌株和伴放線放線桿菌A.actinomycetemcomitans ATCC29522 菌株購于四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心；牛心腦浸液（brain heart infusion，BHI）血瓊脂培養(yǎng)基購于青島日水生物技術(shù)有限公司；DNA 提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。

1.2 臨床資料

選擇濟(jì)南市口腔醫(yī)院牙周科就診的青少年牙齦炎初診患者89 例，其中男47 例，女38 例，年齡12～16 歲，平均年齡14.3 歲；選擇42 例牙周健康者組成對照組，男19 例，女23 例，年齡12-16 歲，平均14.6 歲；均為山東地區(qū)常住居民。要求患者無全身系統(tǒng)性疾病，3 個(gè)月內(nèi)未接受過系統(tǒng)的牙周治療，未曾服用抗生素和引起牙齦增生的藥物。且知情同意。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 臨床指標(biāo)的測定

牙齦指數(shù)(Gingivitis index, GI)[6]

按照LOe 和Silness1967 年修定的標(biāo)準(zhǔn)，吹干牙齦，觀察牙齦色、形、質(zhì)的改變程度，用牙周探針放入齦緣下0.5-1mm,并輕輕滑動后觀察有無出血。將每個(gè)牙的牙齦分為4 個(gè)區(qū)域：頰側(cè)近中齦乳頭，頰側(cè)邊緣齦，頰側(cè)遠(yuǎn)中齦乳頭及舌側(cè)邊緣齦，分別記錄以上四個(gè)區(qū)域的炎癥情況，將每個(gè)牙的4 個(gè)記分相加除以4，即為該牙的分值。

分級標(biāo)準(zhǔn)為：

0=牙齦正常

1=牙齦輕度炎癥，輕度顏色改變、輕度水腫、探針不出血；

2=牙齦中度炎癥，顏色發(fā)紅，水腫光亮、探診出血；

3=牙齦重度炎癥；明顯發(fā)紅和水腫、或有潰瘍、有自發(fā)出血傾向。

1.3.2 標(biāo)本采集

由同一位醫(yī)師對患者進(jìn)行臨床檢查和標(biāo)本收集，牙周檢查指標(biāo)包括牙齦指數(shù)(Gingivitis index, GI)、齦溝出血指數(shù)（sulus bleeding index,SBI）、菌斑指數(shù)（plaque index,PLI）和探針深度（probing depth,PD）。采用無菌紙尖法采集患者齦溝液，具體采集方法如下：常規(guī)清水漱口，生理鹽水沖洗，去除食物殘?jiān)?，棉球隔濕，吹干，將無菌紙尖插入齦溝內(nèi)，當(dāng)有阻力時(shí)停止插入，停留30s 后取出，放入1mL PBS 的EP 管內(nèi)，-20℃保存待測[7]。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株及齦溝液DNA 提取

（1）標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA 提?。翰捎肈NA 提取試劑盒提取標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA。用紫外分光光度計(jì)測量所提取DNA 在260 nm 和280 nm 處的吸光度值（OD 值），計(jì)算二者比值（比值為1.7～2.0 表示DNA 純度良好）。將各種細(xì)菌DNA 稀釋至相同濃度，用于PCR 反應(yīng)。

（2）齦溝液DNA 提?。簩?biāo)本離心（12000 r/min，2min，最大離心半徑為6cm），棄上清，于沉淀中加入Triton 抽提液，100℃水浴10min，再離心（12000 r/min，2min），取上清作為模板，于-20℃保存[8]。

1.3.4 P.gingivalis 和4 種rag 基因型引物設(shè)計(jì)及合成

參考文獻(xiàn)[4,9]設(shè)計(jì)P.gingivalis16S rDNA 和4 種rag 基因型特異性引物序列（表1），引物均由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

表1 P.gingivalis16S rDNA 和4 種rag 基因型的引物序列

1.3.5 PCR 擴(kuò)增16S rDNA PCR 反應(yīng)體系

采 用2×EasyTaq PCR SuperMix PCR 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），PCR 混合液12.5μL，引物各1.0μL（10uM），模板DNA：標(biāo)準(zhǔn)株1.0μL（100ng/μL），臨床標(biāo)本5.0uL，用無菌雙蒸水補(bǔ)充至總體積25μL。多重PCR 反應(yīng)體系：采用TransStart Taq DNA PolymerasePCR 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），10 倍反應(yīng)緩沖液2.5μL，引物2.0μL（將未經(jīng)稀釋的4 對rag 基因引物的原始液混合后按1 對引物稀釋的量進(jìn)行稀釋，稀釋后的引物作為應(yīng)用液，計(jì)作引物A），TaqDNA 聚合酶0.5μL，dNTPs0.5μL，模板DNA5.0μL，用無菌雙蒸水補(bǔ)充至總體積25μL。PCR 循環(huán)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火30s(16SrDNAPCR為57℃，多重PCR 為55℃)，72℃延伸1min（33 個(gè)循環(huán)）；最后72℃延伸10min；4℃保存。

1.3.6 16S rDNA PCR 及多重PCR 對臨床標(biāo)本的檢測

以16S rDNA 為引物，以臨床標(biāo)本DNA 為模板，用于臨床標(biāo)本檢測，確定P.gingivalis 陽性患者；以P.gingivalis 陽性患者DNA 為模板，以引物A 為引物進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，確定致病島rag 基因的分布情況。

1.3.7 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測取擴(kuò)增產(chǎn)物，用TAE 電泳緩沖液，1.5%瓊脂糖凝膠電泳[含0.5mg/L 溴化乙錠（EB）]，泳動90V 20min。用Ladder DNA Marker（100 bp）確定產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量，以凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用χ2檢驗(yàn)比較組間P.gingivalis 及致病島rag 基因檢出率的差異；Spearman 等級相關(guān)分析P.gingivalis 及致病島rag基因檢出率與牙齦指數(shù)GI 之間的關(guān)系：采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包分析處理，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.1.1 P.gingivalis16S rDNA PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果

陽性對照a 和臨床標(biāo)本c ～ e，g～i,k～l 均擴(kuò)增出404 bp目的條帶，空白對照b 和臨床標(biāo)本f,j 及陰性對照m,n 未見目的條帶。見圖1。

2.1.2 多重PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)菌株b 和臨床標(biāo)本e,i 均擴(kuò)增出628bp（rag-1）目的條帶，臨床標(biāo)本h 擴(kuò)增出979bp（rag-2）目的條帶,臨床標(biāo)本c,d,f,g,j 擴(kuò)增出423bp（rag-3）目的條帶, 標(biāo)準(zhǔn)菌株a 和臨床標(biāo)本f,j,l 均擴(kuò)增出739bp（rag-4）目的條帶，臨床標(biāo)本k未見目的條帶。見圖2。

圖1 P.gingivalis16S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖2 4 種rag 基因型特異性引物PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 PCR 檢測結(jié)果

以16S rDNA 引物PCR 擴(kuò)增131 例患者臨床標(biāo)本，其中牙齦炎組擴(kuò)增出63 例，陽性率70.79%；對照組擴(kuò)增出15 例，陽性率35.71%。牙齦炎組明顯高于對照組，兩者之間有顯著性差異（P＜0.01）。

以引物A 為引物PCR 擴(kuò)增78 例P.gingivalis 陽性患者臨床標(biāo)本，擴(kuò)增出rag 基因的有61 例，陽性率78.21%,其中牙齦炎組54 例，陽性率85.71%；對照組7 例，陽性率46.67%。牙齦炎組明顯高于對照組，兩者之間有顯著性差異（P＜0.01）。（見表1）。

表1 普通PCR 及多重PCR 對臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果

2.3 P.gingivalis 及致病島rag 基因檢出率與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系（表2）。

表2 P.gingivalis 及致病島rag 基因檢出率與牙齦指數(shù)之間的關(guān)系

用Spearman 等級相關(guān)分析P.gingivalis 及致病島rag基因檢出率均與牙齦指數(shù)GI 之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。

牙齦炎組各項(xiàng)牙周檢查指標(biāo)（PLI、SBI 和PD）均顯著高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

牙周致病菌的存在是牙周病發(fā)生的必要條件（始動因子），牙齦卟啉單胞菌是目前公認(rèn)的慢性牙周炎的主要致病菌之一，在口腔乃至全身感染性疾病中檢出率極高，與臨床厭氧菌感染的關(guān)系十分密切。它具有顯著的毒力或致病性，能通過多種機(jī)制干擾宿主防御能力，具有引發(fā)牙周破壞的潛能。致病島(Pa thogen icity island)的發(fā)現(xiàn)使人們對細(xì)菌致病性有了進(jìn)一步的認(rèn)識。致病島又稱毒力島，是伴隨腸道致病菌基因組結(jié)構(gòu)和致病性研究逐步被揭示的。致病島是指編碼細(xì)菌毒力基因簇的一個(gè)相對分子質(zhì)量較大的片段,是整合于細(xì)菌基因DNA 組的外源性成分,推測其來自于細(xì)菌進(jìn)化過程中DNA 的基因水平轉(zhuǎn)移事件。通過這一過程,細(xì)菌獲得編碼毒力因子的大片段的致病島基因。大片段DNA 的致病島基因的轉(zhuǎn)移對宿主菌的致病能力或性狀改變顯著,且與細(xì)菌進(jìn)化和新病原菌出現(xiàn)有關(guān)。一種病原菌往往具有1 個(gè)或幾個(gè)致病島，致病島存在于強(qiáng)毒株中，一般弱毒株或無毒株中缺失[10-11]。目前，rag 位點(diǎn)被確定是P.gingivalis 的致病島基因之一[4,12]。Rag 由RagA、RagB 兩個(gè)基因編碼組成，其中RagA基因的DNA 序列分析顯示由氨基酸的前肽區(qū)（當(dāng)?shù)鞍酌讣せ顣r(shí)該區(qū)被切斷）、蛋白酶區(qū)及羥基端的粘附區(qū)構(gòu)成；而RagB無粘附區(qū)，其蛋白酶區(qū)、前肽區(qū)與RagA 基因的相應(yīng)段緊密相關(guān)[13]RagA、RagB 基因分別編碼RagA 和RagB 蛋白。RagA是TonB 類受體外膜蛋白；而RagB 是一種表面抗原，rag 蛋白構(gòu)成膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，協(xié)助細(xì)菌從外部環(huán)境獲取轉(zhuǎn)運(yùn)大分子，有助于細(xì)菌的存活和散播；同時(shí)Rag 蛋白還能夠激活宿主的免疫及炎癥反應(yīng)[4]。Curtis 等[14]用PCR 技術(shù)分析ragB 在齦下菌斑的分布，發(fā)現(xiàn)rag+的牙齦卟啉單胞菌在深牙周袋比在淺牙周袋位點(diǎn)更易檢測到。研究說明rag 基因可能影響牙齦卟啉單胞菌的潛在毒力。rag 位點(diǎn)在臨床菌株中有4 種基因型，分別命名為rag-1、rag-2、rag-3 和rag-4[4,12]。

近年來,隨著分子生物學(xué)發(fā)展,基因檢測技術(shù)得以應(yīng)用,多重PCR 技術(shù)(multiplex -polymerase chain reaction)直接檢測未培養(yǎng)臨床標(biāo)本中的致病菌,為在基因水平上P.gingivalis的快速、敏感、特異的診斷提供了可靠手段。該檢測技術(shù)是在一次反應(yīng)中同時(shí)加入多對引物，對同一份模板DNA 樣品中不同序列同時(shí)擴(kuò)增，由于每對引物對所擴(kuò)增的產(chǎn)物片段長短不同，因而通過電泳系統(tǒng)易區(qū)分，所以PCR 可以同時(shí)檢測多個(gè)病原菌或一種病原菌中的多個(gè)致病基因型[15]。但由于多重PCR 要求在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增，因而技術(shù)難度增大，一個(gè)理想的多重PCR 反應(yīng)體系，并非單一PCR 的簡單混合，需要針對目標(biāo)產(chǎn)物，進(jìn)行全面分析、反復(fù)試驗(yàn)，建立適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。該技術(shù)在檢測口腔病原菌方面已有較多應(yīng)用。García 等[16]應(yīng)用多重PCR 成功地對伴放線放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌進(jìn)行了檢測。占定鳳等[17]建立了多重16S rDNA PCR 可同時(shí)檢測慢性牙周炎標(biāo)本中牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌和齒垢密螺旋體，并證明所建立的多重16S rDNA PCR 有較高的敏感性和特異性。本研究采用改良聚合酶鏈反應(yīng)-多重PCR 檢測技術(shù),通過優(yōu)化多重PCR 反應(yīng)條件可以直接檢測臨床標(biāo)本中牙齦卟啉單胞菌不同Rag 基因型的分布，具有簡單快速的特點(diǎn)，并且具有較高的敏感性和特異性。本研究中131 例患者臨床標(biāo)本，共擴(kuò)增出P.gingivalis78 例，其中牙齦炎組擴(kuò)增出63 例，陽性率70.79%；對照組擴(kuò)增出15 例，陽性率35.71%。牙齦炎組明顯高于對照組，兩者之間有顯著性差異（P＜0.01）。78例P.gingivalis 陽性患者臨床標(biāo)本，擴(kuò)增出rag 基因的有61 例，陽性率78.21%, 其中牙齦炎組54 例，陽性率85.71%；對照組7 例，陽性率46.67%。牙齦炎組明顯高于對照組，兩者之間有顯著性差異（P＜0.01）。用Spearman 等級相關(guān)分析P.gingivalis致病島rag 基因檢出率與牙齦指數(shù)GI 之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。研究結(jié)果表明P.gingivalis 致病島rag 基因與細(xì)菌致病性密切相關(guān)，在青少年牙齦炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。