何勇勇，方長英，李 萍，張青松，朱傳衛(wèi)

(1.宣城職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)科教研室，安徽 宣城 242000；2.宣城市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 宣城 242000)

肝癌發(fā)病率位居世界第6，也是死亡率位居第4的癌癥，其中肝細(xì)胞癌占所有肝癌病例的75%～85%[1]。肝細(xì)胞癌惡性程度較高，早診斷早治療是提高生存率關(guān)鍵所在，積極尋找有效的血清分子標(biāo)志物對早期肝癌進(jìn)行篩查和預(yù)后評估是一條重要途徑。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一種長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。研究表明lncRNAs在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，可以作為分子標(biāo)志物用于肝癌診斷和預(yù)后判斷[2-3]。前列腺癌基因表達(dá)標(biāo)記物1(prostate cancer gene expression marker 1，PCGEM1)是最早在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的lncRNA[4]，研究發(fā)現(xiàn)PCGRM1可充當(dāng)某些microRNA(例如miR-145和miR-148a)的競爭性內(nèi)源RNA，在前列腺細(xì)胞中發(fā)揮致癌作用[5-6]。本研究探討PCGEM1在早期原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者外周血中的表達(dá)及其對診斷和預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年3月—2019年12月在宣城市中心醫(yī)院普外科接受肝癌切除術(shù)治療的70例原發(fā)性肝細(xì)胞癌早期患者作為研究對象，其中男性62例，女性8例；年齡31～71歲，平均(49.04±9.26)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前未做任何治療的初診患者；(2)2位病理科醫(yī)生確診為肝細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者伴有嚴(yán)重心肺疾病、肝炎、肝硬化、高血壓、腦出血、嚴(yán)重糖尿病和其他惡性腫瘤等疾病。另外選擇同期體檢的70名健康成年志愿者作為對照組，其中男性61例，女性9例；年齡25～68歲，平均(49.40±8.86)歲。肝癌患者和志愿者在身高、體重、性別、年齡和生活方式等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。本研究獲得宣城市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本采集 在肝癌患者術(shù)前3 d和術(shù)后6 d采集15 mL血液，在志愿者體檢時(shí)采集15 mL血液。血液樣本采集后即刻5 000 r/min離心5 min，取上清移至無酶EP管中進(jìn)行RNA提取和cDNA合成。

1.2.2 RNA提取和cDNA合成 取250 μL血清和750 μL TRIzol(Invitrogen公司)加入無酶EP離心管中，混勻后加入氯仿，振蕩后冰上靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清移至無酶EP離心管中，隨后加入等量異丙醇冰上放置15 min后12 000 r/min離心，棄去上液，加入1 mL 75%乙醇，12 000 r/min離心15 min，洗滌后用適量無酶ddH2O溶解RNA，分光光度計(jì)測量RNA濃度為670 ng/μL，OD260/280為 1.96。采用 PrimeScriptTMRT reagent kit(Invitrogen公司)將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL：1 μL模板RNA，4 μL 5×PrimeScript緩沖液混合物，1 μL PrimeScript RT酶，1 μL oligo dT引物和 13 μL 無 RNase 的ddH2O；反應(yīng)條件：37℃30 min，85℃5 s，然后4℃孵育60 min，cDNA置-20℃冰箱保存。

1.2.3 qRT-PCR檢測外周血中PCGEM1表達(dá) 依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中提供的PCGEM1和內(nèi)參GAPDH序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列并交由上海吉瑪生物科技公司合成，PCGEM1上游引物：5′-TGCCTCAGCCTCCCAATA AC-3′，下游引物：5′-GGCCAAAATAAAACCAA ACAT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CAGGAGG CATTGCTGATGAT-3′，下游引物：5′-GAAGGCT GGGGCTCATTT-3′。按照Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen公司)說明書使用7500熒光定量PCR儀(ABI公司)對PCGEM1進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)體系20 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用2-ΔΔCT方法計(jì)算早期肝細(xì)胞癌患者和健康體檢者血液中PCGEM1表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較使用t檢驗(yàn)，采用受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線分析PCGEM1在血液中的表達(dá)對肝癌早期診斷和Edmondson-Steiner分級預(yù)測的價(jià)值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCGEM1在早期肝癌患者血清中的表達(dá)

肝癌患者術(shù)前血清中PCGEM1的表達(dá)量高于健康對照組和術(shù)后患者(均P＜0.001)；而肝癌患者術(shù)后和健康對照組血清中PCGEM1的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.079，P=0.937)。見表1。結(jié)果表明早期肝癌患者血清中PCGEM1表達(dá)量高于健康人群，肝癌切除術(shù)后其表達(dá)量下降至正常水平。

表1 PCGEM1在各組中的相對表達(dá)量 (n=70，±s)

表1 PCGEM1在各組中的相對表達(dá)量 (n=70，±s)

1)：與對照組相比，P＜0.001；2)：與肝癌術(shù)后組相比，P＜0.001。

組別對照組肝癌組(術(shù)前)肝癌組(術(shù)后)PCGEM1表達(dá)量1.880±0.793 3.231±0.9421)2)1.871±0.528

2.2 血清中PCGEM1對早期肝癌的診斷價(jià)值

ROC分析結(jié)果顯示PCGEM1診斷早期肝癌的曲線下面積為0.865(95%CI： 0.802～0.928，P＜0.001)，最優(yōu)截?cái)嘀禐?.685，其敏感性和特異性分別為71.4%和91.4%，見圖1。

圖1 PCGEM1診斷早期肝癌的ROC曲線

2.3 血清中PCGEM1對肝癌細(xì)胞分級的預(yù)測

ROC分析結(jié)果表明PCGEM1預(yù)測肝癌細(xì)胞Edmondson-Steiner分級的曲線下面積為0.903(95%CI： 0.820～0.985，P＜0.001)，最優(yōu)截?cái)嘀禐?.115，其敏感性和特異性為97.4%和77.4%，見圖2。

圖2 PCGEM1預(yù)測肝癌細(xì)胞Edmondson-Steiner分級的ROC曲線

2.4 血清中PCGEM1表達(dá)與肝癌臨床病理特征間的關(guān)系

腫瘤直徑＞5 cm、無腫瘤包膜和Edmondson-Steiner分級差(Ⅲ級和Ⅳ級)的早期肝癌患者的PCGEM1表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，見表2。

表2 PCGEM1表達(dá)與早期肝癌病理特征的關(guān)系

3 討論

本研究顯示早期肝癌患者外周血液中PCGEM1的表達(dá)升高且與腫瘤大小、包膜有無和肝細(xì)胞癌Edmondson-Steiner分級相關(guān)；ROC分析結(jié)果顯示外周血中PCGEM1的表達(dá)用于診斷早期肝癌的敏感性和特異性分別為71.4%和91.4%；血液中PCGEM1相對表達(dá)值＞3.115的患者肝癌細(xì)胞分化差，預(yù)示腫瘤惡性度高，其敏感性和特異性為97.4%和77.4%。此外，有研究證實(shí)PCGEM1過表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，Zhang等[7]的研究表明宮頸癌患者腫瘤組織中PCGEM1過表達(dá)與FIGO晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及較差的總體生存率相關(guān)，PCGEM1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、遷移和侵襲，同時(shí)抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果均證實(shí)了PCGEM1具有癌基因的特征。近年來，越來越多的證據(jù)表明lncRNAs可通過競爭性結(jié)合microRNA形成競爭性內(nèi)源RNA，在細(xì)胞生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[8]，研究顯示PCGEM1與miR-182結(jié)合形成競爭性內(nèi)源RNA，上調(diào)FBXW11的表達(dá)[7]，F(xiàn)BXW11屬于F-box蛋白家族的FBXW亞家族，可通過調(diào)節(jié)底物磷酸化和泛素化在各種信號傳導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用[9]，例如：FBXW11通過激活NF-κB信號通路促進(jìn)黑素瘤、腸癌和皮膚癌等惡性腫瘤的進(jìn)展[10-11]。此外，F(xiàn)BXW11可通過激活NF-κB和β-catenin/TCF信號通路誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞白血病的細(xì)胞周期進(jìn)程和腫瘤形成[12]，PCGEM1在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制是否與上述信號通路有關(guān)還需進(jìn)一步研究。但可以明確PCGEM1可通過多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，致使患者易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，從而復(fù)發(fā)率升高，生存率下降。

本研究發(fā)現(xiàn)患者外周血中PCGEM1過表達(dá)對肝癌早期診斷具有較好的臨床價(jià)值。血液樣本易獲得，lncRNAs檢測較為簡單，通過檢測外周血lncRNA PCGEM1的表達(dá)對早期肝癌進(jìn)行篩查將是一個(gè)行之有效的臨床方法，但由于其他腫瘤細(xì)胞和組織中PCGEM1也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。因此，應(yīng)用PCGEM1對肝癌高危人群進(jìn)行篩查時(shí)，表達(dá)升高的篩查對象需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢查(血清甲胎蛋白檢查)和影像學(xué)檢查，以明確是否發(fā)生肝細(xì)胞癌。綜上所述，對于已經(jīng)確診的肝細(xì)胞癌患者，lncRNA PCGEM1表達(dá)量越高則腫瘤較大且惡性程度高，提示患者預(yù)后可能較差。