李潛 汪林寶 羅佩嘉 韋林 劉玉鋼 任磊鵬 丁超

目前，表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“表型藥敏試驗(yàn)”)仍是檢測(cè)MTB耐藥性的主要方法，但結(jié)果報(bào)告時(shí)間較長(zhǎng)，如BACTEC MGIT 960(簡(jiǎn)稱“MGIT 960”)培養(yǎng)的平均時(shí)間為18 d[1]；而研究較多的基因芯片和測(cè)序技術(shù)具有檢測(cè)敏感度高，儀器試劑成本也高[2]的特點(diǎn)，不利于基層推廣使用；故具有較高敏感度及特異度的熒光PCR熔解曲線法(real-time PCR melt curve，簡(jiǎn)稱“PCR熔解曲線法”)成為技術(shù)成本較低且檢測(cè)速度較快的新型檢測(cè)MTB耐藥性的應(yīng)用技術(shù)[3-4]。結(jié)核性膿胸常規(guī)采用手術(shù)治療及手術(shù)前后規(guī)范抗結(jié)核治療，但術(shù)前病灶標(biāo)本的采集、檢測(cè)方法的選擇成為影響MTB培養(yǎng)陽(yáng)性率、耐藥篩查率和患者手術(shù)前后抗結(jié)核治療有效性的關(guān)鍵[5]。為進(jìn)一步探討PCR熔解曲線法在結(jié)核性膿胸術(shù)中標(biāo)本快速耐藥篩查中的應(yīng)用價(jià)值，本研究分析150例結(jié)核性膿胸患者的相關(guān)臨床資料，為臨床診治提供參考。

對(duì)象和方法

一、 研究對(duì)象

搜集2019年1月至2020年6月符合入組標(biāo)準(zhǔn)的150例結(jié)核性膿胸患者不同手術(shù)標(biāo)本(組織和膿液)，分別送檢MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性后行表型藥敏試驗(yàn)、PCR熔解曲線法核酸檢測(cè)陽(yáng)性后行耐藥基因檢測(cè)，比較兩種方法對(duì)結(jié)核性膿胸不同手術(shù)標(biāo)本病原學(xué)及耐藥性的檢出率。其中男120例，女30例；年齡10～68歲，中位年齡為26歲；左側(cè)65例，右側(cè)85例，無雙側(cè)；病程1～120個(gè)月，中位病程為4個(gè)月；術(shù)前抗結(jié)核藥品治療時(shí)間為1～36個(gè)月，中位治療時(shí)間為3個(gè)月。手術(shù)標(biāo)本均來自膿胸病灶清除術(shù)及胸膜剝脫術(shù)切開病灶時(shí)即刻采集的膿液和組織標(biāo)本，各150份。

結(jié)核性膿胸確診依據(jù)(符合其一即可)：(1)術(shù)前胸腔穿刺標(biāo)本MTB MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性且MPB64單克隆抗體測(cè)定為MTB菌株；(2)組織病理檢查表現(xiàn)為典型結(jié)核肉芽腫性炎伴干酪樣壞死。

二、 術(shù)中標(biāo)本檢測(cè)方法

1.MGIT 960培養(yǎng)：采用BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)，參照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[6]操作。術(shù)中標(biāo)本(組織、膿液)靜置后取 2～3 ml 沉淀樣本加入 1～2 倍體積的4%NaOH，渦旋振蕩2～3 次，室溫靜置15 min，加PBS緩沖液至40 ml，離心后棄上清加入1.5 ml PBS 緩沖液，振蕩混勻放置10 min后取0.5 ml加入BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)管中，放入BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。

2.MGIT 960表型藥敏試驗(yàn)：將MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性的術(shù)中標(biāo)本接種至MGIT 960管進(jìn)行異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星藥敏試驗(yàn)[7]。

3.MTB PCR熔解曲線法核酸檢測(cè)：取1～3 ml標(biāo)本量，置無菌管內(nèi)加入2～3倍體積的4%NaOH溶液，37 ℃恒溫處理30 min，使其充分液化(無明顯固狀物且吸出時(shí)無拖絲現(xiàn)象)。取1 ml消化液加入到相應(yīng)編號(hào)的1.5 ml無菌離心管中，15 000×g離心5 min。去上清液，沉淀加入無菌生理鹽水1 ml打勻，15 000×g離心5 min；再重復(fù)洗滌1次。留取沉淀進(jìn)行DNA提取。

以下操作按照中山大學(xué)達(dá)安基因公司提供的試劑盒說明進(jìn)行，擴(kuò)增用BIORAD-CFX96熒光定量擴(kuò)增儀。取3～5 ml標(biāo)本量于無菌管內(nèi)，2000×g離心1 min，取上清液1 ml加入到1.5 ml無菌離心管中，15 000×g離心5 min；吸去上液，留100 μl；再加入1 ml，重復(fù)離心1次，去上清液留沉淀進(jìn)行DNA提取，篩選出核酸陽(yáng)性標(biāo)本后送檢熔解曲線法檢測(cè)。標(biāo)本當(dāng)天不進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，置2～8 ℃冰箱保存。結(jié)果判定：Ct值(即循環(huán)閾值)<40定義為陽(yáng)性，可送PCR熔解曲線檢測(cè)，但因30≤Ct值<40結(jié)果誤差較多，本研究將其納入陰性統(tǒng)計(jì)；Ct值≥40定義為陰性，不進(jìn)行PCR熔解曲線檢測(cè)。

4.PCR熔解曲線法耐藥基因檢測(cè)：由廈門致善生物科技股份有限公司研發(fā)。取實(shí)時(shí)定量熒光PCR熔解曲線法初篩為陽(yáng)性并處理好的標(biāo)本1 ml加入有螺旋蓋的前處理管中，加入相當(dāng)于標(biāo)本2倍體積的處理液，旋緊管口振蕩15～30 s，室溫靜置15 min 打開反應(yīng)盒，取2 ml處理好的標(biāo)本由加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒，然后將反應(yīng)盒放在檢測(cè)模塊，檢測(cè)異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、氟喹諾酮類藥品的耐藥基因。按設(shè)定好的程序進(jìn)行擴(kuò)增和熔解曲線分析；反應(yīng)結(jié)束后在窗口下直接觀察結(jié)果[8]。

由于前期研究及經(jīng)費(fèi)原因，當(dāng)同一例患者的膿液和組織標(biāo)本相同技術(shù)檢測(cè)MTB同時(shí)為陽(yáng)性時(shí)，則僅送檢其中一種標(biāo)本行PCR熔解曲線法耐藥基因或MGIT 960表型藥敏試驗(yàn)，即同一標(biāo)本不同時(shí)采用兩種技術(shù)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 兩種技術(shù)對(duì)不同術(shù)中標(biāo)本檢測(cè)MTB的檢出結(jié)果

300份術(shù)中標(biāo)本(膿液和組織)，PCR熔解曲線法核酸檢測(cè)MTB的總體陽(yáng)性率(44.0%，132/300)明顯高于MGIT 960培養(yǎng)(18.0%，54/300)(χ2=47.405，P=0.000)。

PCR熔解曲線法核酸檢測(cè)Ct值<30(即陽(yáng)性)的組織標(biāo)本占比(50.0%)明顯高于膿液標(biāo)本的占比(38.0%)，而MGIT 960培養(yǎng)檢測(cè)組織標(biāo)本的陽(yáng)性占比(12.7%)明顯低于膿液標(biāo)本(23.3%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，見表1。

二、兩種技術(shù)病原學(xué)診斷陽(yáng)性結(jié)果的比較

進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，MGIT 960培養(yǎng)、PCR熔解曲線法、兩種方法聯(lián)合檢測(cè)150例患者的病原學(xué)診斷陽(yáng)性占比(只要其中1種方法檢測(cè)為陽(yáng)性即判定該例患者為病原學(xué)陽(yáng)性)分別為30.7%、66.7%、70.7%。MGIT 960培養(yǎng)與PCR熔解曲線法檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果比較，以及MGIT 960培養(yǎng)與聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而PCR熔解曲線法與聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表1 不同手術(shù)標(biāo)本(組織、膿液)應(yīng)用兩種技術(shù)檢測(cè)MTB陽(yáng)性結(jié)果的比較

表2 150例患者采用兩種技術(shù)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果的比較分析

表3 兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)5種藥品的耐藥性檢出情況比較

三、兩種技術(shù)對(duì)術(shù)中標(biāo)本MTB的耐藥檢出情況

132份PCR熔解曲線法核酸檢測(cè)和54份MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中，100例有PCR熔解曲線法耐藥基因檢測(cè)結(jié)果，46例有MGIT 960表型藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，僅40例患者同時(shí)有兩種技術(shù)的耐藥檢測(cè)結(jié)果。以40例為研究對(duì)象，MGIT 960表型藥敏試驗(yàn)和PCR熔解曲線法耐藥基因檢測(cè)對(duì)異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星的耐藥檢出率分別為20.0%和17.5%、17.5%和15.0%、17.5%和17.5%、17.5%和22.5%、5.0%和7.5%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，見表3。

討 論

結(jié)核病一直是全球性傳染病中重要的衛(wèi)生問題[9]，且耐藥結(jié)核病例數(shù)近年來呈不斷上升趨勢(shì)。《2019全球結(jié)核病報(bào)告》[10]估算全球利福平耐藥結(jié)核病患者約為48.4萬例，其中耐多藥結(jié)核病患者約占78%；在全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中，利福平耐藥結(jié)核病患者最多的3個(gè)國(guó)家依次為印度(13.0萬例,占全球的27%)、中國(guó)(6.6萬例，占14%)和俄羅斯(4.1萬例，占9%)，中國(guó)仍然是全球耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。耐多藥結(jié)核病的早期診斷和治療是目前結(jié)核病控制的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一，明顯降低了結(jié)核病的治愈率。

目前，胸外科常見于胸膜的第五類型結(jié)核病為結(jié)核性膿胸[11]，臨床上一般通過抗酸染色或培養(yǎng)檢測(cè)患者胸腔膿液或胸膜活檢組織樣本中是否存在抗酸桿菌為診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，或在排除其他肉芽腫性疾病的情況下，能夠在胸膜組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)干酪樣壞死肉芽腫組織[12]。此類疾病往往在全身抗結(jié)核藥品治療后進(jìn)一步行手術(shù)治療，雖常規(guī)對(duì)患者行耐藥性篩查，但難以克服以下問題：其一，術(shù)前獲取標(biāo)本為有創(chuàng)方式，可能存在感染或穿刺傷口長(zhǎng)期不愈的風(fēng)險(xiǎn)；其二，術(shù)前穿刺采集標(biāo)本較困難，無法針對(duì)性取材，且送檢多為膿液標(biāo)本，培養(yǎng)結(jié)果陰性較多，若反復(fù)送檢會(huì)增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；其三，MTB生長(zhǎng)緩慢，至少2～4周以上才能確定其藥敏試驗(yàn)結(jié)果[13]，此時(shí)部分患者往往已行手術(shù)治療，如果患者為耐多藥結(jié)核病，術(shù)后將有可能造成結(jié)核病復(fù)發(fā)或播散。因此，提高標(biāo)本送檢陽(yáng)性率、快速進(jìn)行耐藥性檢測(cè)篩查、指導(dǎo)臨床醫(yī)師判斷抗結(jié)核藥品的耐藥程度尤為重要[14]。

隨著近年來結(jié)核病分子診斷技術(shù)的新興與發(fā)展，早期快速診斷耐藥突變技術(shù)不斷涌現(xiàn)，這些基于分子層面的分析可有效用于快速鑒定抗生素耐藥性相關(guān)的基因突變和單核苷酸多態(tài)性。分子測(cè)序具有高可靠性，但因價(jià)格昂貴而難以廣泛用于微生物實(shí)驗(yàn)室[15]；另外，基因診斷法明顯縮短了藥敏試驗(yàn)周期，但在我國(guó)只能用于MTB對(duì)異煙肼和利福平耐藥突變基因的檢測(cè)。2016年9月廈門致善生物科技股份有限公司繼2013年推出的異煙肼和利福平耐藥突變檢測(cè)試劑后又推出乙胺丁醇、鏈霉素、氟喹諾酮類藥品耐藥突變PCR熔解曲線法檢測(cè)試劑，可同時(shí)檢測(cè)MTB對(duì)五種抗結(jié)核藥品的耐藥突變，是目前檢測(cè)藥品品種較全面的MTB藥敏試驗(yàn)分子檢測(cè)試劑。PCR熔解曲線法是一種簡(jiǎn)單快速的PCR檢測(cè)技術(shù)，其主要檢測(cè)原理為耐藥基因的基因突變會(huì)導(dǎo)致DNA雙鏈的結(jié)合力下降，從而導(dǎo)致相應(yīng)的熔解溫度(Tm)值下降，即野生型基因有特定的Tm值，而突變型基因因?yàn)榻Y(jié)合能力下降導(dǎo)致Tm值發(fā)生變化，據(jù)此可以區(qū)分和檢測(cè)出突變型和野生型。PCR 熔解曲線法檢測(cè)具有一定的全面性，在技術(shù)層面PCR熔解曲線法采用閉管法，即將檢測(cè)樣本和檢測(cè)試劑集中于反應(yīng)管中，在反應(yīng)過程中無須打開，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，有利于反應(yīng)后熔解曲線的分析，且檢測(cè)可在3 h內(nèi)完成[16]。

由于手術(shù)患者術(shù)前已行較長(zhǎng)時(shí)間的抗結(jié)核藥品治療，使得大量敏感活菌死亡，而耐藥菌被篩選出來，因此有必要對(duì)結(jié)核性膿胸術(shù)后的耐藥性進(jìn)行篩查。本研究采集了結(jié)核性膿胸術(shù)中病灶組織及膿液標(biāo)本，分別送檢MGIT 960和PCR熔解曲線法檢測(cè)病原學(xué)和耐藥性，結(jié)果表明PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB的陽(yáng)性率明顯高于MGIT 960，故建議手術(shù)標(biāo)本應(yīng)優(yōu)先PCR熔解曲線法行MTB核酸篩檢；而不同手術(shù)標(biāo)本送檢的陽(yáng)性率也存在差異，其中送檢PCR熔解曲線法的陽(yáng)性標(biāo)本中，組織標(biāo)本(占比50.0%)明顯高于膿液標(biāo)本(占比38.0%)，而送檢MGIT 960的組織標(biāo)本(12.7%)明顯低于膿液標(biāo)本(23.3%)，與沈煉[17]對(duì)膿液培養(yǎng)陽(yáng)性率(21.95%)的研究結(jié)果相近。可能因?yàn)樾g(shù)前經(jīng)過抗結(jié)核藥品治療后，大部分敏感活菌死亡造成MTB DNA釋放，組織標(biāo)本通過纖維板包裹后核酸含量較高，而膿液中由于抗結(jié)核藥品通過組織擴(kuò)散較為困難，導(dǎo)致殘留活菌量較多。故建議行PCR熔解曲線法檢測(cè)時(shí)優(yōu)選組織標(biāo)本送檢，行MGIT 960檢測(cè)時(shí)優(yōu)選膿液標(biāo)本，可在一定程度上指導(dǎo)臨床醫(yī)師送檢，增加送檢陽(yáng)性率，減少重復(fù)送檢，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。進(jìn)一步對(duì)150例患者病原學(xué)診斷陽(yáng)性率的分析發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)送檢MGIT 960并不能達(dá)到國(guó)家要求50%以上的標(biāo)準(zhǔn)，而PCR熔解曲線法、兩種方法聯(lián)合檢測(cè)均超過了65%，均明顯高于MGIT 960，但后兩者檢測(cè)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示聯(lián)合檢測(cè)并不優(yōu)于單獨(dú)的PCR熔解曲線法，認(rèn)為PCR熔解曲線法的陽(yáng)性檢出率已較高，基本包含了MGIT 960檢出的陽(yáng)性患者，聯(lián)合檢測(cè)并沒有提高患者的陽(yáng)性檢出率。故認(rèn)為現(xiàn)階段雖然MGIT 960在病原學(xué)檢測(cè)中必不可少，但并不能滿足臨床需求，而PCR熔解曲線法在快速獲得結(jié)果的同時(shí)，不僅能滿足國(guó)家對(duì)病原學(xué)陽(yáng)性檢出率的要求，還可以進(jìn)一步檢測(cè)患者的耐藥性，對(duì)術(shù)后抗結(jié)核治療進(jìn)行指導(dǎo)。

本研究PCR熔解曲線法耐藥基因檢測(cè)與MGIT 960藥敏試驗(yàn)對(duì)異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星的耐藥檢出率分別為20.0%和17.5%、17.5%和15.0%、17.5%和17.5%、17.5%和22.5%、5.0%和7.5%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Pang等[18]、吳慧娜等[19]和宋華峰等[20]的報(bào)道接近，說明PCR熔解曲線法耐藥基因檢測(cè)對(duì)異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星的耐藥檢出率與MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，且檢測(cè)時(shí)間短，認(rèn)為結(jié)核性膿胸患者可根據(jù)PCR熔解曲線法的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果制定術(shù)后抗結(jié)核藥品方案，為耐藥結(jié)核病的治療贏得時(shí)間[21]。但是，PCR熔解曲線法基因也存在一定的局限性，該方法篩選中不包含氨基酸序列，可能會(huì)將不引起氨基酸改變的沉默突變歸為突變一類，造成假陰性結(jié)果[22]；同時(shí)，由于分子生物學(xué)檢測(cè)的耐藥基因位點(diǎn)尚不完善，檢測(cè)藥品種類少，暫時(shí)無法檢測(cè)除左氧氟沙星以外的其他二線抗結(jié)核藥品的耐藥性[23]，對(duì)后期耐藥結(jié)核病的治療指導(dǎo)有限，但隨著分子生物學(xué)檢測(cè)的快速發(fā)展，相信這一技術(shù)會(huì)成為臨床上重要的檢測(cè)方法。

綜上所述，結(jié)核性膿胸患者術(shù)中病灶送檢PCR熔解曲線法核酸檢測(cè)MTB的總體陽(yáng)性率明顯高于MGIT 960培養(yǎng)，且組織標(biāo)本送檢該方法檢測(cè)的陽(yáng)性率高于膿液標(biāo)本，耐藥檢出率與MGIT 960表型藥敏試驗(yàn)相近，可快速檢測(cè)MTB陽(yáng)性及耐藥性，可為術(shù)中精準(zhǔn)取材及術(shù)后用藥提供一定的指導(dǎo)。