益 莎

（東營市東營區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務中心，山東 東營257091）

血凝抑制試驗（Hemagglutination inhibition test，HI）是雞新城疫抗體實驗室檢測中最常用的方法，可用于新城疫疫苗免疫后的效果評估及臨床疑似病例的輔助診斷，因其操作簡便、成本低，可進行大量樣本的高通量快速檢測，在基層實驗室中廣泛應用。但影響血凝抑制試驗結果的因素眾多，如紅細胞新鮮程度、抗原種類、稀釋液的種類、血清質(zhì)量、環(huán)境溫度和作用時間等，需要注意各種操作細節(jié)，操作時注意力應高度集中，避免漏加和重復加樣，方能得到最準確的結果，否則可能得出錯誤結果，給養(yǎng)殖戶造成一定的經(jīng)濟損失。筆者結合自己多年工作經(jīng)驗，對操作過程中需要注意的事項歸納總結如下。

1 稀釋液配制

稀釋液可采用0.85%的生理鹽水，也可用磷酸鹽緩沖液（PBS），通常PBS酸堿緩沖能力好，測出的結果更接近真實情況，更準確。但PBS配制相對復雜，且保存時間短、不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)絮狀沉淀，檢測中常用的是pH值7.2 、濃度0.01 mol·L-1的PBS，配制方法為氯化鉀0.2 g、氯化鈉8.2 g、磷酸二氫鈉0.24 g、磷酸氫二鈉1.44 g，加去離子水1000mL，攪拌溶解充分混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.2，分裝后121℃高壓滅菌15min，室溫保存?zhèn)溆谩栏窨刂芇BS的pH值，否則可能會導致自凝或吸附于紅細胞上的病毒脫落，建議條件不好的基層試驗室選用生理鹽水做稀釋液，配制簡單、方便，即使不會配也可以購買醫(yī)用商品化試劑，相對穩(wěn)定可靠，對試驗結果幾乎無任何影響。

2 紅細胞懸液制備

制備紅細胞懸液是要選用SPF雞或健康非免疫雞，多選幾只雞，采集的血液混合，也可選用免疫過疫苗的淘汰雞，但洗滌紅細胞時一定要多洗幾遍?？鼓齽┛刹捎米约号渲频陌⑹弦?。配制方法：在100mL去離子水中加入葡萄糖2.05 g、氯化鈉0.42 g、檸檬酸0.055 g、檸檬酸鈉0.8 g，攪拌溶解，調(diào)節(jié)溶液pH值為6.1，高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆茫?個月內(nèi)用完。使用時阿氏液與抽取血液的最終比例為1∶1。紅細胞洗滌時選用“V”型尖底15mL離心管，加約4倍稀釋液，吸管輕吹混勻后3000r·min-1離心5min，反復洗滌3次以上。吸取紅細胞時吸管插到底部，不要吸取表層，配制濃度一般為1%，濃度偏低時測得的血清血凝抑制效價偏低，濃度偏高時測得的血清血凝抑制效價偏高，離心轉(zhuǎn)速不要太高，吹吸紅細胞操作不要太劇烈，否則可能造成紅細胞破裂溶血，同一試驗用同一批紅細胞。也可使用醫(yī)用抗凝采血管，采集雞血液時一定要充分混勻，防止血液局部凝集。配制的紅細胞懸液最好當天使用，時間不要超過3d。

3 4 單位凝集抗原配制

4單位血凝抗原的配制濃度是影響試驗結果準確性的重要環(huán)節(jié)，濃度偏高時測出的結果偏低，濃度偏低時測得的結果偏高。4單位抗原最好現(xiàn)用現(xiàn)配，配制后室溫下4h內(nèi)用完，切記不要反復凍融，以免影響抗原效價。同次試驗或同批次試驗用相同的4單位抗原，效價高的濃縮抗原穩(wěn)定性和效果更好。每次使用前要吹吸搖勻，加樣后振蕩。疫苗免疫效果檢測時最好選用疫苗廠家提供的抗原配制4單位血凝抗原，不同毒株測出的抗體效價不同，最多可差2～3個效價。

4單位抗原配后的驗證方法：將25μL4單位抗原等量倍比稀釋，使每孔含有4、2、1、0.5 個血凝單位，再加等量人紅細胞懸液，判定結果。4、2、1個血凝單位孔紅細胞出現(xiàn)完全凝集為合格。鑒于影響血凝抑制反應的因素眾多，某些基層實驗室的4單位抗原需多次調(diào)整，費心費力，個人認為對試驗結果沒有太大影響的情況下可根據(jù)實際情況適當提高4單位抗原濃度，以提高工作效率。

4 器材的選擇和使用

血凝板常選用一次性V型96孔板，90°或110°均可以，反應板形狀規(guī)則，無漏洞褶皺，清潔、光滑。如采用可重復利用的舊反應板時，一定要保證清洗干凈并烘干。加樣時應加入到板底部，不可加的太慢，不要濺出。

所用移液器要定期檢定校準，用后調(diào)回最大量程，配備適宜吸頭，保證安裝牢固，避免漏氣。吸取液體時輕輕的反復吹吸，防止氣泡的產(chǎn)生，用力均勻，防止移液量不準。吸取時應做到“慢吸快打”，防止移液器吸入液體，從而腐蝕柱塞致漏氣。加樣前應先吸取溶液1次，濕潤吸頭，防止因吸頭內(nèi)壁殘留的“液膜”造成排液量小的誤差。加4單位抗原或紅細胞時，吸頭垂直加入液體，并保持管嘴與凝集板孔間的距離，防止樣品間交叉污染。先加低濃度抗原孔，再加高濃度孔，保證每個孔內(nèi)加入液體量準確無誤。加樣完畢后，把移液器調(diào)回最大量程，并定期校驗，避免結果不準。

一定要選用一次性吸頭，切記重復利用。吸頭不要觸碰到無關的V型板孔，以免發(fā)生交叉污染。振蕩器工作時應勻速平穩(wěn)、無異常抖動，幅度不宜過大，時間不能太長，一般10s左右。用校準的水銀溫度計定期校驗恒溫箱，保證控溫準確。

5 檢測樣品的準備

抗體檢測樣品可以是血清和雞蛋，因采血對雞應激過大，臨床送檢樣品以雞蛋居多，測定卵黃抗體。采樣要合理，采典型樣品，保證無菌操作，采樣量適量。通常按雞群3%的比例隨機抽樣，最低不要少于30份，否則檢測結果不具有代表性。血清檢測輔助疾病診斷時應病死雞與正常雞兼顧，死亡雞可從心房中取血凝塊，分離血清檢測。為保障檢測結果，通常在雞進食前采血，待檢血清需新鮮、無雜質(zhì)、不溶血、無腐敗，盛裝容器要清潔，正常雞血清狀態(tài)為清亮透明或微黃色。穿刺方法要正確，注入容器時，取下針頭緩慢注入，避免大量泡沫產(chǎn)生，導致溶血。送至實驗室后要立即分離血清，暫時不能分離時，樣品要冷藏保存。溫度在23℃以上時，血清可在2h內(nèi)析出，如果采血時外界環(huán)境中溫度低于10℃，血樣采集后置保溫箱中，切記不讓樣品凍結，待血清析出后5000r·min-1離心5min。有時會出現(xiàn)膠凍樣血清，可用加樣槍頭將膠凍樣血清在離心管壁上擠壓幾下或戳破血再離心。血清忌反復凍融，3d內(nèi)使用，可4℃保存，長期凍存于-20℃。

對產(chǎn)蛋雞而言，通常測卵黃抗體效價代替測血清效價，以減少采血對雞的應激。通常卵黃較血清低1～2個效價，因卵黃的形成需要9～10d的時間，卵黃抗體較血清中抗體的檢測結果有一定滯后性，雞抗體上升期，不可用卵黃代替血清進行抗體監(jiān)測。卵黃萃取和直接稀釋所得檢測結果基本一致，可同時取異常蛋和正常蛋檢測卵黃抗體。

6 試驗的溫度和結果觀察時間

溫度對試驗結果有一定影響，溫度高出現(xiàn)結果的速度快，凝集解脫也快。溫度每提高5℃測得抗體效價平均上升0.35 lg。4℃時紅細胞發(fā)生自凝，37℃以上時產(chǎn)生凝集的紅細胞易洗脫。當室溫為20～25℃，時間一般在30～40min。環(huán)境溫度過低時放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中。反應板遠離風扇、空調(diào)或風機出風口，以免液體揮發(fā)影響結果。紅細胞懸液加入后，待對照紅細胞懸液完全沉淀前后5min內(nèi)判定結果為宜，時間早則不能反映實際抗體水平，時間遲則紅細胞易發(fā)生溶血，導致試驗無效，故凝集板應靜置到規(guī)定時間后觀察結果，中途不能隨時取放。

7 小 結

新城疫抗體檢測的紅細胞凝集試驗方法是應用最廣的方法，尤其在基層獸醫(yī)檢測部門。雖然看似簡單，但要想真正做好，得到真實結果并不容易，有很多細節(jié)性的問題需要注意，需要經(jīng)驗豐富人員長期實踐摸索，需要人員高度認真負責?？贵w測定時要連續(xù)測對樣品結果，根據(jù)抗體變化情況綜合評估分析，方能得出能對臨床生產(chǎn)具有指導意義的數(shù)據(jù)。試驗過程中所用一切稀釋液、紅細胞懸液、4單位抗原要正確配制，尤其是4單位抗原和紅細胞懸液等，加樣時搖勻，避免樣品分布不均造成結果偏差，保證每一次試劑加入準確無誤，操作手法一定要標準，減少各種誤差，爭取檢測結果準確、可靠?？傊麄€試驗過程一定要注意操作的各方面細節(jié)，才能得到最準確的結果。