王振峰(河南化工技師學(xué)院，河南 開封 475000)

1 HPLC介紹

高效液相色譜儀是一種在20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的新型分離分析技術(shù)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，它已經(jīng)成為應(yīng)用廣泛的化學(xué)成分分離分析的主要方法。高效液相色譜儀將液體作為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，通過分析樣品與固定相和流動相發(fā)生選擇作用，使物質(zhì)的各種成分進(jìn)行分離。分離之后，再選擇相應(yīng)的檢測器進(jìn)行成分的檢測，由此對樣品的成分進(jìn)行分析和研究。相比較于傳統(tǒng)的分析方法，高效液相色譜分析的分析速度很快，通常分析一個(gè)樣品只需要30分鐘左右就能完成[2]。HPLC還可以選擇固定相和流動相以此來使自己的分離效果達(dá)到最佳標(biāo)準(zhǔn)，比起其他的分離技術(shù)更加高效節(jié)能。而且HPLC在測定過程中不受樣品揮發(fā)性和穩(wěn)定性的影響，多用它來測定一些其他方法無法測定的高分子化合物。同時(shí)物品經(jīng)過液相色譜儀測定過后，色譜柱不會被破壞，可以重復(fù)的使用，樣品也不會被破壞，能夠進(jìn)行回收再使用。

2 多種成分的分離

2.1 樣品的預(yù)處理

對煙草的化學(xué)成分進(jìn)行分析研究之前最重要的一步就是將煙草中的各類成分分離出來，而分離樣品的關(guān)鍵就是煙草樣品的預(yù)處理，這個(gè)步驟在整個(gè)過程中都是很重要的，它影響著后面測定的成功和失敗以及結(jié)果的準(zhǔn)確性。樣品的處理一般包括樣品的收集和前期制作，色譜分析對于被測定的樣品的預(yù)處理要求很高，它是色譜分析發(fā)展領(lǐng)域中重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。目前根據(jù)資料顯示適用于煙草的預(yù)處理方法主要有以下幾個(gè)方法。

最簡單的就是水蒸氣蒸餾法，這個(gè)方法操作簡單而且比較穩(wěn)定，它可以使煙草中的揮發(fā)性物質(zhì)在還沒有達(dá)到它們沸點(diǎn)的時(shí)候就被蒸餾出來，并且和其他不揮發(fā)性物質(zhì)完全分離。但是這個(gè)方法需要有機(jī)溶劑的量很大。目前常用的方法是溶劑萃取法，它的提取效率很高而且比較便宜。對于固體物質(zhì)的提取通常采用冷浸法或者索式提取法。液相微萃取是近年發(fā)展起來的一種色譜分析樣品處理方法，它相比較于溶劑萃取法，縮短了樣品的萃取時(shí)間，提高了效率和樣品的利用率。是一種操作簡單而且處理效果很好的樣品處理方法之一，目前的應(yīng)用范圍較廣。

2.2 多酚的測定分析

煙草中有很多的酚類化合物，這些物質(zhì)的存在與煙草的色澤和香氣息息相關(guān)。而且煙草里面的酚類化合物一般都不穩(wěn)定，容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。在這個(gè)過程中會生成有色的物質(zhì)，從而影響煙草的顏色。在點(diǎn)燃煙草的時(shí)候，這些物質(zhì)很容易揮發(fā)出來，分解后進(jìn)入到煙氣中，從而影響煙氣的香味，讓煙草的香味增加。目前主要運(yùn)用以下幾種方法對煙草中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行分析?？茖W(xué)家們利用酚類物質(zhì)還原性強(qiáng)的這特點(diǎn)，發(fā)明了容量法來進(jìn)行多酚類物質(zhì)的分析。在實(shí)驗(yàn)中采用多種氧化劑對樣品進(jìn)行滴定處理，然后通過反應(yīng)判斷樣品中的多酚類物質(zhì)含量及組成。這個(gè)方法操作簡單，對設(shè)備等要求較低，但是煙草中還有很多其他具有還原性的物質(zhì)，會對測定的結(jié)果產(chǎn)生影響。所以無法對各種酚類物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確測定。

在1977年，一位科學(xué)家開始使用高效液相色譜儀(HPLC)進(jìn)行煙草中酚類物質(zhì)的分析研究。首先他運(yùn)用色譜柱然后采用了梯度洗脫，得到了19個(gè)化合物的色譜峰，之后用紫外光譜的方法鑒定出了其中的7個(gè)多酚類化合物。之后的Nisseror等人再次使用HPLC進(jìn)行煙草中多酚類物質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)在20 cm×4.6 cm內(nèi)填入5 nm 的Nucleosil的C18色譜柱上，采用甲醇作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，在用紫外光進(jìn)行測定的時(shí)候，可以對煙草中的酚類等物質(zhì)進(jìn)行分析檢測[3]。HPLC法是將各種物質(zhì)分開進(jìn)行測定，采用不同的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行化合物的分析，這樣的操作可以得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，不會被其他的物質(zhì)干擾，但是因?yàn)樗枰M(jìn)行多次的進(jìn)樣然后洗脫分析，操作比較復(fù)雜而且十分耗費(fèi)時(shí)間。因此現(xiàn)在很多的科學(xué)家開始進(jìn)行梯度洗脫這方面的研究，希望可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，提高效率。目前應(yīng)用高效液相色譜儀進(jìn)行這類物質(zhì)的分析已經(jīng)開始取締其他的方法，因此我們也應(yīng)該大力發(fā)展這個(gè)技術(shù)。

2.3 糖類的測定分析

在煙草中糖類與煙草的品質(zhì)有很大的關(guān)系，煙草燃燒的時(shí)候它們可以產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)和一些香氣，降低煙草氣味的刺激性，產(chǎn)生令人感到愉悅的氣味。當(dāng)然含糖量太大也會導(dǎo)致煙草的味道變差，對燃燒產(chǎn)生不良的影響。其中果膠多糖是一種最為復(fù)雜的多糖，它主要由果膠酸和果膠酯酸組成，它是高等植物細(xì)胞壁和相鄰細(xì)胞緊密結(jié)合的一種多糖。目前測定這類物質(zhì)主要是有三種方法。其中經(jīng)典的方法就是重量法，主要的步驟就是將煙草樣品中的游離糖和色素等物質(zhì)通過方法去除，然后得到細(xì)胞壁，再利用溶劑萃取的方法將樣品中的不溶于溶劑的多糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘亩嗵?，再將這些物質(zhì)進(jìn)行沉淀處理，最后分離沉淀得到想要的多糖。比色法也是一種測定糖類的方法，它是利用酸類物質(zhì)將煙草樣品中的果膠多糖分解，再使用硫酸-咔唑顯色進(jìn)行糖類的測定。這兩種方法都有一定的缺陷和不足，無法對果膠多糖的成分進(jìn)行具體的分析。

目前色譜法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于果膠多糖含量的測定和其結(jié)構(gòu)分析，色譜法對比其他的方法而言，分離效率更高、可以多組同時(shí)進(jìn)行分析和適用于樣品的大量分析。色譜分析法一般是將煙草樣品進(jìn)行水解等預(yù)處理之后，再利用氣相色譜法和高效液相色譜法進(jìn)行分析。因?yàn)樘穷愔械膯翁窃谧贤鈪^(qū)基本沒有吸收，直接進(jìn)行液相色譜法的分析效果很差。使用在進(jìn)行單糖的液相色譜法之前都會進(jìn)行衍生化處理，目前的衍生處理一般分為柱前和柱后衍生化，應(yīng)用最廣泛的是柱前衍生化，因?yàn)樗鼘τ谠O(shè)備的要求比柱后衍生化要低很多。采用柱前衍生化對糖類進(jìn)行高效液相色譜的分析和研究，準(zhǔn)確率很高而且還可以同時(shí)測定多種單糖的含量，大大地提高了工作效率和質(zhì)量。

2.4 色素的測定分析

煙草作為一種綠色植物，與其他的植物一樣含有大量的綠色素，其中主要是葉綠素a、葉綠素b和β-胡羅卜素等。色素對于煙草品質(zhì)有著很大的影響，色素很低的話，煙草發(fā)育會受影響，最后使煙草的品質(zhì)大大降低。煙草中色素含量過高，煙草葉子過大的肥厚，會影響煙草后期的質(zhì)量。色素中的葉綠素是煙草生長期間發(fā)生光合作用的關(guān)鍵物質(zhì)，煙草成熟后，葉子逐漸變黃，葉綠素含量開始降低，使煙葉后面被制作成煙草后，降低了燃燒使氣味的刺激性，提高煙草的品質(zhì)。其中色素中的類胡羅卜素對于煙草的氣味和色澤也有重要的影響，它們在降解后會形成許多帶有香味的物質(zhì)。

前期的色素測定一般是使用分光光度法進(jìn)行色素的測定，這個(gè)方法發(fā)展歷史悠久，有著成熟的測定方法，但是這個(gè)方法測定色素得到的結(jié)果比較粗糙，不夠精確?，F(xiàn)在大家都開始采用高效液相色譜法進(jìn)行色素的測定和分析研究，先將煙草樣品使用溶劑萃取法進(jìn)行預(yù)處理，在使用高效液相色譜進(jìn)行分離分析，因?yàn)椴煌纳卦诓煌牟ㄩL紫外線下面具有不同的最大吸收值，因此可以分析出樣品中含有的不同的色素及其含量。采用高效液相色譜對色素進(jìn)行分析研究，將樣品的光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)行對比，可以精準(zhǔn)的進(jìn)行定量分析，方便之后的研究。

2.5 激素的測定分析

植物激素是植物生長過程中必不可少的一種物質(zhì)，它對于植物的生長和發(fā)育起著重要的作用，植物激素的分泌影響著煙草的生長和煙草質(zhì)量。植物激素中的赤霉素和生長素是最重要的兩種激素，也是含量較高的兩種激素。赤霉素可以加速植物細(xì)胞的伸長，提高植物體內(nèi)生長素的含量，促進(jìn)細(xì)胞的分裂和擴(kuò)大，是植物生長過程中必不可少的。植物生長素是一類具有分裂細(xì)胞的激素，它能使植物細(xì)胞壁變得松弛，從而使細(xì)胞進(jìn)行增長，同時(shí)還調(diào)節(jié)RNA和蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。

植物激素的測定方法比較多，最常用的就是氣相色譜法和高效液相色譜法。赤霉素和生長素都是不可揮發(fā)的物質(zhì)，采用氣相色譜法的時(shí)候，還需要進(jìn)行衍生化，這樣處理耗費(fèi)很多時(shí)間而且準(zhǔn)確性不夠高。而且因?yàn)槌嗝顾貨]有多個(gè)共軛雙鍵，吸收比較差，檢測的靈敏度比較低。而且植物激素中還有很多其他的激素，部分激素的含量很少，傳統(tǒng)的檢測分析方法不能精確地將這些激素進(jìn)行分離分析。而運(yùn)用高效液相色譜法進(jìn)行分析的時(shí)候，可以在梯度洗脫過程中將激素進(jìn)行準(zhǔn)確的分離，然后再進(jìn)行各種激素的分析和檢測。采用這個(gè)方法可以大大的節(jié)約時(shí)間，提高工作的效率和準(zhǔn)確性。

3 結(jié)語

煙草是目前世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙草的質(zhì)量決定了它的價(jià)格也關(guān)乎眾多吸煙人士的身體健康。分析和研究煙草的化學(xué)成分是一項(xiàng)不可或缺的工作，通過研究煙草的化學(xué)成分我們可以更好地控制煙草的生產(chǎn)和煙草的質(zhì)量。但是目前關(guān)于煙草化學(xué)成分的研究還處于基本的階段，本文主要簡述了通過高效液相色譜儀對煙草的化學(xué)成分進(jìn)行分離分析。HPLC是一種新型的檢測復(fù)雜化合物的手段，與其他的檢測方法比較，可以更加精準(zhǔn)地進(jìn)行樣品的分析，而且它的效率更高。

運(yùn)用HPLC檢測煙草中的糖類，可以顯著的提高檢測的靈敏度，希望隨著技術(shù)的進(jìn)步以后在使用HPLC的同時(shí)結(jié)合其他的檢測器，這樣對于檢測結(jié)果可以更加準(zhǔn)確。采用高效液相色譜儀對煙草中的多酚進(jìn)行檢測，利用梯度洗脫，可以同時(shí)進(jìn)行多種酚類物質(zhì)的檢測和分析，大大提高了工作的效率。測定煙草中的色素的時(shí)候，采用高效液相色譜法對煙葉加工的多個(gè)階段進(jìn)行采樣分析，可以得出在煙葉生長和制成煙草后煙葉里面不同色素含量的區(qū)別，可以幫助我們更加了解煙草的生長和生產(chǎn)，對于提高煙草的品質(zhì)有著重要的作用。同時(shí)利用HPLC對煙草的激素進(jìn)行測定，可以方便知道什么激素在什么含量對于煙草的生長最有利，這樣就方便以后對煙草的生長激素進(jìn)行調(diào)節(jié)，提高煙草的質(zhì)量和品質(zhì)。通過這些化學(xué)物質(zhì)的測定和分析，對于煙草的種植、加工和防護(hù)有著重要的作用，也可以為其他的研究提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)知識。