柯蕊，和平，吳媛媛，張永紅，張偉，劉原

西安交通大學第二附屬醫(yī)院，西安710004

肺動脈高壓（PH）是一類常見肺血管疾病，表現(xiàn)為靜息狀態(tài)下肺動脈壓力升高，同時合并不同程度右心功能衰竭。PH在全球發(fā)病率為1%，在年齡超過65歲的人群中可達10%，嚴重危害人類健康［1］。目前臨床上治療PH的靶向藥物不良反應多、治療費用昂貴，導致患者治療依從性降低，給PH的治療帶來挑戰(zhàn)。白藜蘆醇（RES）是一種植物來源的多酚化合物和植物雌激素，在防治腫瘤及血管增殖性疾病中具有重要研究價值［2-3］。在PH的研究中也發(fā)現(xiàn)，RES可抑制肺動脈平滑肌細胞（PASMC）增殖，降低動物模型的肺動脈壓力并逆轉(zhuǎn)肺血管重塑，提示RES可能成為PH治療的潛在藥物［4-5］。RES是沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）的天然激活劑［6］。SIRT1是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙?；?，能夠去乙?；M蛋白和多種轉(zhuǎn)錄因子，參與DNA損傷修復、氧化應激及細胞衰老、凋亡和增殖等過程的調(diào)控［7］。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可上調(diào)叉頭蛋白O3a（FOXO3a）表達，并通過促進FOXO3a乙?；鰪娖滢D(zhuǎn)錄活性［8-9］。而FOXO3a可促進細胞周期抑制蛋白如p27的表達，使細胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制多種腫瘤細胞增殖［10-11］。然而，RES是否能激活SIRT1/FOXO3a/p27信號通路發(fā)揮抑制PASMC增殖的作用，目前尚未見報道。5-羥色胺（5-HT）是一種重要的促細胞有絲分裂原，我們前期研究已發(fā)現(xiàn)1 μmol/L 5-HT可明顯刺激PASMC增殖［12］。2020年3月—8月，我們通過1 μmol/L 5-HT刺激原代PASMC增殖，探討RES是否可通過激活SIRT1/FOXO3a/p27信號通路發(fā)揮抑制PASMC增殖的作用，以期為防治肺血管重塑及PH提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SD大鼠由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國 Gibco公司；5-HT、SIRT1抑制劑EX527、FOXO3a抑制劑AS1842856購自美國Sigma公司；RES購自上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；BrdU細胞增殖檢測試劑盒購自上海麥約爾生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；大鼠p27 siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；兔抗大鼠α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗購自英國Abcam公司；FITC標記的山羊抗兔IgG購自中杉金橋生物技術(shù)公司；兔抗大鼠SIRT1、FOXO3a、p27單克隆抗體購自美國CST公司；兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體、HRP標記抗兔二抗購自美國Sigma公司。

1.2 原代大鼠PASMC的培養(yǎng)與鑒定 取健康SD大鼠2只，體質(zhì)量70～80 g；腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，取出大鼠心臟和肺臟組織，采用組織貼塊法培養(yǎng)原代PASMC。應用抗α-SMA免疫熒光染色鑒定其純度，血管平滑肌細胞純度≥90%，可用于實驗研究。

1.3 RES對PASMC增殖抑制作用觀察及作用濃度篩選 取第3～6代處于對數(shù)生長期的PASMC，以2.5×104/mL接種96孔板，在37℃下貼壁24 h，1%FBS-DMEM培養(yǎng)基饑餓過夜，使細胞生長同步化，更換10%FBS-DMEM培養(yǎng)基，將PASMCs分為對照組、5-HT刺激組、不同濃度RES干預組。不同濃度RES干預組在加入1 μmol/L 5-HT前用不同濃度RES（10、30、100、300 μmol/L）預處理1 h，5-HT刺激組僅加1 μmol/L 5-HT，對照組不處理，每組設(shè)6個復孔。作用24 h后，采用BrdU摻入法檢測各組細胞增殖情況。終止細胞培養(yǎng)前8 h加入BrdU繼續(xù)培養(yǎng)，隨后固定細胞、變性DNA、清洗細胞；加入BrdU抗體培養(yǎng)細胞，再次清洗細胞后加入辣根過氧化物酶標記的二抗培養(yǎng)；清洗細胞后加入TMB底物顯色，加入反應終止液后用多功能酶標儀在370 nm波長處讀取光密度（OD），計算細胞增殖率。增殖率=（干預組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。選取與5-HT刺激組比較，首次出現(xiàn)統(tǒng)計學差異的RES干預組的濃度作為后續(xù)實驗的RES作用濃度。

1.4 SIRT1/FOXO3a/p27信號通路在RES抑制PASMC增殖中的作用觀察

1.4.1 SIRT1、FOXO3a、p27在RES抑制PASMC增殖中的作用觀察 取第3～6代處于對數(shù)生長期的PASMC，以2.5×104/mL接種96孔板，37℃貼壁24 h；1%FBS-DMEM培養(yǎng)基饑餓過夜，使細胞生長同步化；更換10%FBS-DMEM培養(yǎng)基，將PASMCs分為對照組、5-HT刺激組、RES干預組、RES+SIRT1抑制劑干預組、RES+FOXO3a抑制劑干預組、RES+p27 siRNA轉(zhuǎn)染組。對照組不處理，5-HT刺激組僅加1 μmol/L 5-HT，RES干預組在加入1 μmol/L 5-HT前用1.3篩選的RES濃度預處理1 h，RES+SIRT1抑制劑干預組、RES+FOXO3a抑制劑干預組在加入1 μmol/L 5-HT前用RES分別聯(lián)合1 μmol/L EX527、AS1842856預處理1 h，RES+p27 siRNA轉(zhuǎn)染組在加入1 μmol/L 5-HT前預先轉(zhuǎn)染p27 siRNA 24 h后聯(lián)合RES。取各組作用24 h的細胞，采用BrdU摻入法檢測細胞增殖情況，方法同1.3。

1.4.2 SIRT1/FOXO3a在RES影響FOXO3a、p27蛋白/p27蛋白表達中的作用觀察 取第3～6代處于對數(shù)生長期的PASMC，以（1～2）×105/mL接種6孔板，細胞生長至70%～80%融合后的處理同1.4.1；將細胞分為對照組、5-HT刺激組、RES干預組、RES+SIRT1抑制劑干預組、RES+FOXO3a抑制劑干預組，細胞處理同1.4.1；作用24 h后，采用Western blotting法檢測對照組、5-HT刺激組、RES干預組、RES+SIRT1抑制劑干預組的FOXO3a、p27蛋白及RES+FOXO3a抑制劑干預組的p27蛋白。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h；加入稀釋后的FOXO3a及p27一抗，4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗，室溫下孵育2 h；ECL顯色，采用Bio-Rad成像系統(tǒng)檢測條帶，采集圖像，采用Quantity One軟件進行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。所有數(shù)據(jù)以-x±s表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩組間比較用Tukey post-hoc檢驗，重復測量數(shù)據(jù)行重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RES對PASMC增殖抑制作用及作用濃度篩選結(jié)果 5-HT刺激組PASMC增殖率為163.28%±14.25%，高于對照組的100.00% ±16.23%（P＜0.05）。10、30 μmol/L RES干預組PASMC增殖率分別為153.11% ±13.24%、142.07% ±20.73%，與5-HT刺激組比較差異無統(tǒng)計學意義。100、300 μmol/L RES干預組PASMC增殖率分別為135.53%±14.77%、128.18% ±13.52%，均低于5-HT刺激組（P均＜0.05），故以100 μmol/L作為后續(xù)實驗中RES干預的作用濃度。

2.2 SIRT1、FOXO3a、p27在RES抑制PASMC增殖中的作用 5-HT刺激組PASMC增殖率為165.19%±14.35%，高于對照組的100.00% ±14.66%（P＜0.05）；RES干預組PASMC增殖率為135.83% ±12.33%，低于5-HT刺激組（P＜0.05）；RES+SIRT1抑制劑干預組、RES+FOXO3a抑制劑干預組、RES+p27 siRNA轉(zhuǎn)染組ASMC增殖率分別為158.99%±10.58%、153.03% ±13.30%、156.11% ±10.25%，高于RES干預組（P均＜0.05），三組間差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 SIRT1/FOXO3a在 RES影響 FOXO3a、p27蛋白/p27蛋白表達中的作用 5-HT刺激組PASMC中FOXO3a、p27蛋白表達量分別為0.54± 0.09、0.50±0.06，均低于對照組的1.00± 0.09、1.00± 0.06（P均＜0.05）；RES干預組PASMC中FOXO3a、p27蛋白表達量分別為0.91±0.08、0.82±0.06，均高于5-HT刺激組（P均＜0.05）；RES+SIRT1抑制劑干預組PASMC中FOXO3a、p27蛋白表達量分別為0.64±0.12、0.61±0.05，均低于RES干預組（P均＜0.05）；RES+FOXO3a抑制劑干預組p27蛋白表達量為0.64±0.08，低于RES干預組（P＜0.05）。

3 討論

PH是一種常見的臨床綜合征，目前的治療藥物雖在一定程度上降低了患者的肺動脈阻力和壓力，但這些藥物常伴有較明顯的不良反應，且治療費用極為昂貴。RES是一種天然多酚化合物，主要來源于紅葡萄、花生等，是植物在應激反應、損傷以及病毒感染后產(chǎn)生的一種植物抗毒素。其藥理作用廣泛，包括抗炎、抗氧化、抗細胞增殖、抗衰老等。近年來的研究表明，RES可以降低多種腫瘤的發(fā)病率以及逆轉(zhuǎn)血管增殖性疾病的血管重塑［2-4］。本研究發(fā)現(xiàn)RES可以抑制PASMC增殖，提示RES可能成為治療PH的潛在藥物。

SIRT1在血管中表達豐富，在血管穩(wěn)態(tài)及血管重塑中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［7］。大量證據(jù)表明，SIRT1在PH患者及動物模型的肺組織中低表達，并參與肺血管重塑的調(diào)控，在PH中起抑制作用。SIRT1還能通過調(diào)控多種下游分子的表達，從而抑制細胞周期進展以及PASMC的增殖［13］。FOXO3a蛋白是叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，通過轉(zhuǎn)錄激活或抑制下游靶基因，在細胞增殖、凋亡、自噬和炎癥等方面發(fā)揮重要作用，且其表達和轉(zhuǎn)錄活性受到SIRT1的調(diào)控［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)，RES可通過SIRT1上調(diào)FOXO3a蛋白表達，從而抑制血管平滑肌增殖以及血管重塑的發(fā)生［14］。本研究也發(fā)現(xiàn)，RES可明顯上調(diào)SIRT1蛋白表達，并抑制PASMC增殖；而預先抑制SIRT1可逆轉(zhuǎn)RES對PASMC增殖的抑制作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，RES可上調(diào)FOXO3a蛋白表達，而預先抑制SIRT1可逆轉(zhuǎn)RES對FOXO3a蛋白的上調(diào)。以上結(jié)果提示，RES通過激活SIRT1/FOXO3a信號通路抑制PASMC增殖。

p27蛋白是負性細胞周期調(diào)節(jié)蛋白家族的重要成員之一，通過抑制Cyclin D1-CDK4/CDK6復合物以及Cyclin E-CDK2復合物的激酶活性，從而阻礙細胞從G1期進入S期，負向調(diào)控細胞周期的進行。研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤細胞中p27蛋白表達降低，且與腫瘤患者預后呈正相關(guān)。上調(diào)p27蛋白表達可抑制細胞周期的進展和細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，p27蛋白是FOXO3a的下游重要靶點之一，F(xiàn)OXO3a蛋白可上調(diào)p27蛋白表達，使細胞周期阻滯，從而抑制哺乳動物細胞增殖［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)，RES可明顯上調(diào)p27蛋白表達以及抑制PASMC增殖，抑制SIRT1或FOXO3a蛋白可阻斷RES對p27蛋白表達的上調(diào)以及對PASMC增殖的抑制作用。以上結(jié)果提示，RES通過激活SIRT1/FOXO3a信號通路上調(diào)p27蛋白表達，從而促進PASMC增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，RES可明顯抑制PASMC增殖，并上調(diào)FOXO3a及p27蛋白表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，預先采用SIRT1或FOXO3a特異性抑制劑或轉(zhuǎn)染p27 siRNA可逆轉(zhuǎn)RES對PASMC增殖的抑制作用。抑制SIRT1可阻斷RES對FOXO3a和p27蛋白表達的上調(diào)，抑制FOXO3a蛋白亦可阻斷RES對p27的上調(diào)。以上研究結(jié)果提示，RES可通過激活SIRT1蛋白，上調(diào)FOXO3a蛋白，進而上調(diào)細胞周期抑制蛋白p27，最終抑制PASMC增殖。本研究證實了RES對PASMC增殖的抑制作用以及潛在機制，為研發(fā)新的靶向治療藥物提供了思路。但目前RES在PH中的治療作用仍處于臨床前研究階段，其治療PH的有效性、安全性及最佳治療劑量等問題仍需進一步的臨床試驗來驗證。