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        牛結(jié)節(jié)性皮膚病的實驗室診斷與防治

        2021-01-10 02:10:43桂芳內(nèi)蒙古錫林郭勒盟烏拉蓋管理區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心026321
        獸醫(yī)導(dǎo)刊 2021年3期
        關(guān)鍵詞:痘病毒結(jié)節(jié)性病原

        桂芳/內(nèi)蒙古錫林郭勒盟烏拉蓋管理區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 026321

        1 病原

        病原是結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(LSDV),屬DNA 病毒羊痘的痘病毒家族包括羊痘病毒(SPV),山羊痘病毒(GPV)和LSDV,具有97%的核苷酸同一性,并且在血清學(xué)上具有交叉保護作用。盡管Capripox 的其他菌株感染綿羊和山羊,但LSDV 與牛有關(guān)。LSDV 以兩種傳染形式存在:具有單個外膜的成熟病毒體(MVS)和專門用于細(xì)胞間擴散的包膜病毒體(EV)具有附加膜。

        2 簡介

        宿主對LSDV 感染的易感性受許多因素影響。CaPV 感染的免疫主要是細(xì)胞介導(dǎo)的,因為大多數(shù)子代病毒仍保留在被感染的細(xì)胞內(nèi)。通過在本地直接在細(xì)胞之間傳播,該病毒不在循環(huán)抗體的范圍內(nèi)。通過從受感染細(xì)胞中萌芽釋放的細(xì)胞外包膜病毒體,可能感染鄰近細(xì)胞或逃逸到血液中,并在全身傳播。LSDV 的傳播是通過蚊子,蒼蠅和蜱。

        已知對牛的LSDV 感染具有天然抵抗力,并且亞臨床LSDV感染很常見。LSDV 造成重大的經(jīng)濟損失,主要是由于導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量嚴(yán)重下降,體重減輕,流產(chǎn),不育和生皮損害。為了成功地控制LSD,所有易感動物的疫苗接種被認(rèn)為是主要支柱,并輔之以其他控制措施,例如撲滅,動物移動限制和媒介控制。

        3 臨床特征

        該疾病的特征是發(fā)燒、皮膚黏膜和內(nèi)臟器官上的結(jié)節(jié)性病變。可能會出現(xiàn)牛奶產(chǎn)量減少,生皮受損,暫時或永久不育和受感染動物死亡的情況,從而在受影響的國家造成重大的經(jīng)濟后果。臨床體征的嚴(yán)重程度取決于病毒的株系和被感染牛的品種。傳播主要是通過叮咬昆蟲的間接接觸。LSDV 的平均潛伏期為6 ~9d。該疾病的平均死亡率約為10%。

        4 材料與方法

        4.1 動物和組織采樣從受影響的動物中收集生物標(biāo)本。在實驗室進行檢測。從患病動物的脖子和頭部收集結(jié)節(jié)性皮膚病變的皮膚刮擦5mL 血樣。尸檢是對表現(xiàn)出與LSD 一致的病死牛進行的。從這些動物中收集肺,腎,肝和心臟的一小部分進行測試。

        制備樣品,在提取DNA 之前,將皮膚樣品置于磷酸鹽緩沖液(1X PBS)中1h。一塊(約1.3cm2用剪刀將每個內(nèi)部器官(肝,腎,心臟和肺)切成小塊,并匯集在一起(總量不超過5g)。使用研缽和研棒,少量研磨加入8mL 1×PBS 的樣品。將樣品(皮膚或合并的內(nèi)部器官)勻漿。勻漿后,將漿液倒入15mL EP 中,并以8000 rpm 離心10min。將所得的上清液中提取DNA。試劑盒還可用于從血液樣本中提取DNA。研缽和研棒之間用漂白劑消毒。

        4.2 實驗室檢測抗體檢測:采集全血,分離血清用于抗體檢測,可采用病毒中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法。

        4.3 病毒中和試驗使用標(biāo)準(zhǔn)程序測試血清樣本(n= 80),該程序?qū)⒅泻椭笖?shù)確定為首選方法。針對恒定稀釋的測試血清滴定病毒株。以此方式,需要更大體積的測試血清,但是消除了確保50%組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID50)為100 的困難。根據(jù)可用的OIE 程序,使用羊睪丸(LTe)細(xì)胞在96 孔板中進行測試。

        病原檢測:采集皮膚結(jié)痂、口鼻拭子、抗凝血等用于病原檢測。病毒核酸檢測可采用實時PCR 等方法,病毒分離鑒定可采用細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒,動物回歸試驗等方法。

        4.4 實時PCR 測試內(nèi)部器官樣本進行檢測。使用Taq 聚合酶,10x PCR 緩沖液,50mM MgCl 2 和10mM dNTPs 制備PCR 主混合物。將總共5μL 提取的樣品DNA 或模板對照添加到15μL 制備的預(yù)混液中,總體積為20μL。使用對應(yīng)的熱循環(huán)條件,在PCR 儀器上進行反應(yīng)。在樣品測試之前,將陽性模板對照(PTC)從1pg/μL 連續(xù)稀釋至0.001fg/μL,并在PCR 儀器上運行。合成循環(huán)閾值(C T)vs. PTC濃度曲線的對數(shù)給出3.76的斜率,對應(yīng)于92%的擴增效率(每個循環(huán)100%加倍)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,在后續(xù)測量中使用濃度為1 fg/μL 的PTC。

        5 控制措施

        對患病動物的治療因情況而異,但通常包括使用碘對皮膚病變進行消毒以及用磺胺治療繼發(fā)性細(xì)菌感染。采取預(yù)防措施,包括控制動物的活動以及限制車輛進入受影響農(nóng)場的交通。

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