李文娣 吳雷琪 黃全忠

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis， As)是機(jī)體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的一種慢性反應(yīng)[1]，As 的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激損傷、血脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[2]。 AS 損傷的各時(shí)期均存在細(xì)胞凋亡，而斑塊中凋亡的細(xì)胞包括血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)。 VSMCs 是血管壁的主要成分，其結(jié)構(gòu)和功能的異?？蓪?dǎo)致成熟AS 斑塊不穩(wěn)定以及心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展[3-4]，而VSMCs 的過(guò)度增殖和凋亡是造成動(dòng)AS 發(fā)生病變的關(guān)鍵因素。

白皮杉醇(piceatannol，PCT)是一種具有較強(qiáng)抗氧化活性的多酚物質(zhì)，可以清除自由基，提高機(jī)體免疫力[5]。 有研究證實(shí)，PCT 還具有抑制炎癥反應(yīng)與抵抗細(xì)胞凋亡的作用[6]，并且能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低癌癥的發(fā)生率[7-8]。 而關(guān)于白皮杉醇在抑制AS 進(jìn)展及預(yù)防介入治療心血管疾病的研究卻不多。 本文以過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide， H2O2)為凋亡誘導(dǎo)劑，觀察白皮杉醇對(duì)H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 凋亡的影響及相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)變化，探討其抗凋亡機(jī)制。

材料與方法

1.動(dòng)物 健康，雄性Sprague-Dailey 大鼠，15只，體質(zhì)量平均(100±10)g，購(gòu)于北京生命科學(xué)研究所，動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(京)2018-0022。

2.試劑 白皮杉醇(PCT，＞98%)，DMEM，F(xiàn)BS和MTT 購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司，兔抗Bcl-2、Bax、caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、

鼠抗β-actin、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG 等抗體以及Bio-Rad 試劑盒購(gòu)于美國(guó)Millipore 公司，LDH 測(cè)定試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒，Annexin V/PI 凋亡試劑盒和Hoechst 33258 均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。 其他試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3.VSMCs 獲取與培養(yǎng) 摘取健康雄性SD 大鼠胸主動(dòng)脈血管，除去血管中粘連的結(jié)締組織和脂肪組織，刮取血管中膜，將其剪成約1 mm×1 mm 組織塊，貼于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37 ℃，5% CO2條件下用含20% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液每3 d更換1 次。 待生長(zhǎng)至60% ～80%融合時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代。 倒置相差顯微鏡下觀測(cè)原代VSMCs 為梭形，長(zhǎng)成致密細(xì)胞層時(shí)出現(xiàn)典型的“峰-谷”狀結(jié)構(gòu)。 實(shí)驗(yàn)中使用第3～8 代細(xì)胞。

4.分組與處理 (1)400 μM H2O2處理VSMCs不同時(shí)間(1，2，4，8 h)誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)氧化損傷。

(2)不同濃度H2O2(100，200，400，800 μM)處理VSMCs 2 h 以誘導(dǎo)過(guò)氧化損傷。

(3)白皮杉醇(piceatannol，PCT)預(yù)處理2 h 后，H2O2繼續(xù)處理2 h，具體分為五組:①對(duì)照組(control)，VSMCs 正常培養(yǎng)2 h；②H2O2組，VSMCs 在含有400 μM H2O2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h；③10 μM PCT＋400 μM H2O2，10 μM PCT 預(yù)處理VSMCs 2 h后，400 μM H2O2繼續(xù)處理VSMCs 2 h；④20 μM PCT＋400 μM H2O2，20 μM PCT 預(yù)處理VSMCs 2 h后，400 μM H2O2繼續(xù)處理VSMCs 2 h；⑤40 μM PCT＋400 μM H2O2，40 μM PCT 預(yù)處理VSMCs 2 h后，400 μM H2O2繼續(xù)處理VSMCs 2 h。

5.MTT 法 將VSMCs 以1×105個(gè)/孔的密度接種到96 孔板中，培養(yǎng)24 h。 按1.4 進(jìn)行不同處理后，離心棄上清，每孔加入20 μL 二苯基溴化四氮唑藍(lán)(MTT)溶液，37 ℃孵育4 h，接著加入200 μL 二甲基亞砜(DMSO)，微量震蕩儀震蕩至生成的藍(lán)紫色甲臜完全溶解，于酶標(biāo)儀570 nm 下測(cè)定吸光度(OD)值。

6.LDH 和SOD 測(cè)定 LDH 測(cè)定:VSMCs 按1.4(3)分組進(jìn)行相應(yīng)處理后，吸取培養(yǎng)液，在2 000 r/min，4 ℃下，離心10 min 后，收集上清液按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

SOD 測(cè)定:VSMCs 按1.4(3)分組進(jìn)行相應(yīng)處理后，加入0.25% 胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞；2 000轉(zhuǎn)/min，4 ℃下離心10 min，棄上清；加入1 mL PBS，2000 r/min，4 ℃下離心10 min，重復(fù)3 次。 細(xì)胞沉淀中加入0.5 mL PBS 溶液，重懸并混勻，在冰水浴條件下研磨細(xì)胞，取勻漿液按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

7.Annexin V-PI 檢測(cè) 將VSMCs 以2×105個(gè)/孔的密度接種到6 孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。 待細(xì)胞完全貼壁后，進(jìn)行以下分組處理:①對(duì)照組(control)，VSMCs 正常培養(yǎng)2 h；②H2O2組，400 μM H2O2處理VSMCs 2 h；③PCT 預(yù)處理組，40 μM PCT 預(yù)處理VSMCs 2 h 后，400 μM H2O2繼續(xù)處理VSMCs 2 h。 處理完畢后，用不含EDTA 的胰酶消化并收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌兩次，加入500 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，在細(xì)胞懸浮液加入5 μL Annexin V-FITC，接著加入10 μL PI，室溫避光孵育20 min，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)用CELL QUEST 軟件分析處理。

8.Hoechst 33258 檢測(cè) 將VSMCs 以2×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h。 按1.7 中分三組進(jìn)行相應(yīng)處理后，PBS 洗滌兩次，使用4%多聚甲醛固定15 min，PBS 沖洗，加入Hochest 33258 37 ℃避光染色10 min， PBS 洗滌兩次。 在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)的改變。

9.Western blot 檢測(cè) 收集按1.4(3)分組處理后的VSMCs，分別加入RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，通過(guò)Bio-Rad 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，切膠并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入兔抗Bcl-2(1 ∶1 000)，兔抗Bax(1 ∶1 000)，兔抗caspase-3(1 ∶1 000)，鼠抗β-actin(1 ∶5 000)，兔抗PI3K(1 ∶1 000)，兔 抗p-PI3K(1 ∶ 1 000)，兔 抗Akt(1 ∶1 000)，兔抗p-Akt(1 ∶1 000)，兔抗eNOS(1 ∶500)，兔抗p-eNOS(1 ∶500)在4 ℃下過(guò)夜。 一抗孵育后，TBST 漂洗PVDF 膜3 次，將PVDF 膜與HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 或山羊抗兔IgG 抗體(1 ∶5 000)常溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次后，滴ECL 發(fā)光液進(jìn)行曝光，使用Image J 定量分析目標(biāo)條帶的灰度值。

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOVA 檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.H2O2對(duì)VSMCs 存活率的影響 VSMCs 經(jīng)400 μM H2O2的不同時(shí)間處理后，與對(duì)照組(0 h)比較，H2O2處理1 h 后細(xì)胞存活率顯著下降(P ＜0.05)，而處理2 h 后，降至約為50%(P＜0.01)，8 h后＜20%(P＜0.001，圖1A)。 與對(duì)照組(0 μM)相比，200 μM H2O2處理使細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.01)，400 μM H2O2處理后細(xì)胞存活率約為50%(P＜0.01)，而800 μM H2O2處理后細(xì)胞存活率僅約為30%(P＜0.001)(圖1B)。 結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇400 μM H2O2處理2 h 建立VSMCs 損傷模型，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.PCT 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 存活率的影響VSMCs 經(jīng)不同濃度PCT 處理2 h 后，細(xì)胞活性無(wú)變化(圖2 A)。 VSMCs 經(jīng)不同濃度PCT 預(yù)處理2 h后，再加入400 μM H2O2處理2 h(圖2B)，與對(duì)照組相比，H2O2組存活率顯著降低(P ＜0.01)；與H2O2組相比，不同濃度PCT 預(yù)處理2 h 后均可提高細(xì)胞存活率，且呈劑量依賴關(guān)系，40 μM PCT 預(yù)處理下細(xì)胞存活率可恢復(fù)到80% 左右(P＜0.01)。

3.PCT 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 中SOD、LDH 活力的影響 與對(duì)照組相比，H2O2組VSMCs 中SOD活力顯著下降(P ＜0.01)；與H2O2組相比，VSMCs經(jīng)不同濃度PCT 預(yù)處理2 h 再加400 μM H2O2處理2 h 后，VSMCs 中SOD 活力顯著升高(P＜0.01)(圖3 A)。 與對(duì)照組相比，H2O2組VSMCs 中LDH活力顯著升高(P＜0.01)；用不同濃度PCT 預(yù)處理VSMCs 2 h，再加入400 μM H2O2處理2 h 后，與H2O2組相比，PCT 能夠明顯降低LDH 的活力并呈濃度依賴關(guān)系(圖3B)。

4.PCT 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 凋亡的影響結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用40 μM PCT 進(jìn)行VSMCs的預(yù)處理后檢測(cè)凋亡情況。 結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，H2O2組VSMCs 凋亡率顯著增加(P＜0.01)；與H2O2組比較，40 μM PCT 預(yù)處理后VSMCs 凋亡率則顯著降低(P＜0.01，圖4)。

5.PCT 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 細(xì)胞和細(xì)胞核形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察各組VSMCs(圖5 A)，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)為梭形，細(xì)胞密度大，細(xì)胞邊界清晰；H2O2組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，偽足回縮明顯；40 μM PCT 預(yù)處理后能減輕H2O2所致的VSMCs 損傷，可使細(xì)胞偽足回縮減輕。

Hoechst 33258 結(jié)果顯示，對(duì)照組VSMCs 細(xì)胞核呈圓形、染色質(zhì)均勻、邊緣清晰，藍(lán)色熒光弱，略見(jiàn)細(xì)胞核邊緣不規(guī)則的凋亡細(xì)胞；H2O2組細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)濃染致密的熒光，有細(xì)胞核破裂成碎片狀；而40 μM PCT 預(yù)處理后明顯改善了VSMCs 的細(xì)胞凋亡形態(tài)，減少凋亡細(xì)胞數(shù)量(圖5B)。

圖1 H2O2 對(duì)VSMCs 活力的影響 A:400 μM H2O2 處理VSMCs 不同時(shí)間后的細(xì)胞存活率；B:不同濃度H2O2 處理VSMCs 2 h 后的細(xì)胞存活率，注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05，** P＜0.01， ***P＜0.001

圖2 PCT 對(duì)H2O2 損傷VSMCs 活性的影響A:不同濃度PCT 處理VSMCs 2 h 后的細(xì)胞存活率；B:不同濃度PCT 預(yù)處理VSMCs 2 h，400 μM H2O2 再處理2 h 后的細(xì)胞存活率，注:與對(duì)照組相比，＃＃ P ＜0.01；與H2O2 組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

圖3 PCT 對(duì)H2O2 損傷VSMCs 中LDH、SOD 活力影響 A: 不同濃度PCT預(yù)處理VSMCs 2 h，400 μM H2O2 再處理2 h 后VSMCs 中SOD 活力變化；B: 不同濃度PCT 預(yù)處理VSMCs 2 h，400 μM H2O2 再處理2 h 后VSMCs 中LDH 活力變化 注:與對(duì)照組相比，＃＃P ＜0.01；與H2O2 組相比，* P ＜0.05，**P＜0.01

6.PCT 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 相關(guān)凋亡蛋白的影響 與對(duì)照組相比，400 μM H2O2作用2 h 后，VSMCs 中Bax 和caspase-3 的蛋白表達(dá)水平顯著增加(P＜0.01)，而B(niǎo)cl-2 的蛋白表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01)。 與H2O2組相比，不同濃度PCT 預(yù)處理后，Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)水平隨PCT 濃度增加而逐漸下降(P＜0.01)， Bcl-2 蛋白表達(dá)水平卻逐漸增加(P＜0.05 或P＜0.01，圖6)。

7.PCT 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 中PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響 與對(duì)照組相比，400 μM H2O2處理VSMCs 2 h 后，細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt 和peNOS 的蛋白表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01)；與H2O2組相比，不同濃度PCT 預(yù)處理2 h 后H2O2再處理，p-PI3K、p-Akt、p-eNOS 的蛋白表達(dá)水平逐漸升高，且呈濃度依賴關(guān)系(P＜0.05 或P＜0.01，圖7)。

圖4 Annexin V/FITC 染色檢測(cè)PCT 對(duì)H2O2 損傷VSMCs 凋亡的影響 A:對(duì)照組；B:400 μM H2O2 處理組；C:40 μM PCT＋400 μM H2O2 處理組；D:各組VSMCs 凋亡率， 注: 與對(duì)照組相比，＃＃P ＜0.01，與H2O2 組相比，**P＜0.01

圖5 PCT 對(duì)H2O2 損傷VSMCs 形態(tài)和細(xì)胞核的影響 A: 倒置顯微鏡觀察各組VSMCs 形態(tài)變化；B: Hoechst 33258 檢測(cè)各組VSMCs 凋亡情況。 從左到右依次為:對(duì)照組， 400 μM H2O2 處理組，40 μM PCT＋400 μM H2O2 處理組

討 論

在血管內(nèi)膜損傷的早期，VSMCs 被激活后通過(guò)釋放基質(zhì)金屬蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)、膠原或彈力纖維的解離，促使VSMCs 增殖與遷移，同時(shí)，VSMCs的大量增殖也會(huì)使得新生內(nèi)膜的增厚及血管腔的狹窄，VSMCs 可通過(guò)穩(wěn)固纖維帽而使AS 斑塊穩(wěn)定[1]，但隨著病變發(fā)展到晚期階段，VSMCs 作為AS 發(fā)展中的關(guān)鍵炎癥細(xì)胞，其不正常凋亡及壞死將會(huì)導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定以及血栓的形成[9-10]。 有研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)在AS 的病程發(fā)展中至關(guān)重要，H2O2作為血管細(xì)胞中最重要的活性氧，能夠被過(guò)氧化物酶催化產(chǎn)生氧次氯酸[11]。 因此，本研究建立了由H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激VSMCs 模型，探討了PCT 在AS 中的作用，研究結(jié)果表明，VSMCs 經(jīng)不同時(shí)間和不同濃度的H2O2處理后，其活性明顯下降，導(dǎo)致VSMCs 的死亡數(shù)目增加。

圖6 PCT 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)VSMCs 中相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響 A: Western blot檢測(cè)各處理下VSMCs 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平；B ～D: 各處理下VSMCs 中Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量， 注:與對(duì)照組相比，＃＃P ＜0.01；與H2O2組相比，* P＜0.05，**P＜0.01

圖7 PCT 對(duì)H2O2 處理的VSMCs 中PI3K、Akt、eNOS 磷酸化水平的影響 A:Western blot 檢測(cè)各組VSMCs PI3K-Akt-eNOS 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)；B ～D 依次為:各處理VSMCs 中p-PI3K、p-Akt、p-eNOS 蛋白相對(duì)表達(dá)量 注:與對(duì)照組相比，＃＃P ＜0.01；與H2O2組相比，* P＜0.05，**P＜0.01

通過(guò)本研究表明，PCT 可以對(duì)H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 損傷起到保護(hù)作用，PCT 預(yù)處理VSMCs 可呈濃度依賴地抑制H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 活力降低與凋亡率增加。 LDH 的釋放與細(xì)胞膜完整性相關(guān)，一旦細(xì)胞膜受損，LDH 會(huì)釋放到細(xì)胞外，因此通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH 的水平即可判斷細(xì)胞的受損程度[12]。 SOD 可清除細(xì)胞內(nèi)自由基，對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對(duì)細(xì)胞傷害[13]。 為了進(jìn)一步確定用PCT 預(yù)處理是否可以減輕H2O2誘導(dǎo)的損傷，我們檢測(cè)了VSMCs 中LDH 與SOD 活力，結(jié)果顯示PCT 預(yù)處理可使細(xì)胞內(nèi)LDH 活力下降而SOD 活力升高，證明PCT 可以增強(qiáng)VSMCs 抗氧化能力。

Bcl-2 和Caspase 蛋白家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。 Bcl-2 家族蛋白可通過(guò)影響線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡，其中Bcl-2 具有抑制凋亡的功能，而B(niǎo)ax 可以與Bcl-2 結(jié)合形成異二聚體，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。 本研究結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)下VSMCs 中Bax 和caspase-3 的蛋白表達(dá)水平明顯增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯減少，而PCT 預(yù)處理VSMCs 后，Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)隨PCT 濃度增加而逐漸下降，Bcl-2 蛋白表達(dá)逐漸增加。

PI3K/Akt 信號(hào)通路被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵通路[15]，可起到抑制中性粒細(xì)胞的活化與聚集，減輕細(xì)胞的凋亡以及保護(hù)線粒體等作用。 eNOS 是PI3K/Akt 通路下游的重要底物之一，Akt 可以直接激活eNOS 釋放NO，從而起到保護(hù)冠狀動(dòng)脈、抑制血小板粘附及減輕炎癥反應(yīng)等作用[16]。 已有研究表明，激活PI3K/Akt 通路可促進(jìn)VSMCs 增殖、凋亡與遷移[17]。 本研究結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)下VSMCs 中p-PI3K、p-Akt 和p-eNOS 蛋白表達(dá)水平下降，而PCT 預(yù)處理后p-PI3K、p-Akt 和p-eNOS 的蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性地升高，推測(cè)PCT 抗VSMCs 凋亡作用可能由PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路所介導(dǎo)。

綜上所述，PCT 對(duì)H2O2損傷的VSMCs 具有一定的保護(hù)作用，可以減輕H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 細(xì)胞凋亡，可能是通過(guò)激活PI3K-Akt-eNOS 信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。 本研究為動(dòng)脈粥樣硬化提供了新的治療靶點(diǎn)及治療手段，并為進(jìn)一步闡明動(dòng)脈粥樣硬化以及其他血管增生性疾病的機(jī)理提供了新的視角。 然而，目前對(duì)PCT 的研究還是普遍集中在生物活性上，臨床藥理學(xué)方面的研究和應(yīng)用仍相對(duì)較少，同時(shí)，PCT 對(duì)人體治療的有效性也尚未確立，仍需通過(guò)大量的基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步探討其在心血管疾病的具體作用。