王繼璇

摘要微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)常規(guī)細(xì)菌革蘭染色實(shí)驗(yàn)中，常因細(xì)菌培養(yǎng)物被反復(fù)使用而導(dǎo)致染色結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤。為了提高革蘭染色實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，我們建立了基于10%福爾馬林固定菌液的改良革蘭染色法。該法染色結(jié)果顯示，4°C或室溫放置5或30 d的福爾馬林固定金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌液不僅具有100%染色正確率，同時(shí)還有菌體染色均勻、輪廓清晰、形態(tài)典型等優(yōu)點(diǎn)，不僅提高了革蘭染色實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，同時(shí)也明顯減少了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作量及細(xì)菌培養(yǎng)基使用量，較好的改進(jìn)了革蘭染色實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問題。

關(guān)鍵詞 微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué) 改良革蘭染色法 福爾馬林 細(xì)菌固定

中圖分類號(hào)：Q246文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.16400/j.cnki.kjdk.2021.20.018

A Modified Bacterial Gram-staining Method Suitable for Microbiologic Experimental Teaching

WANG Jixuan

（Zhejiang University， School of Medicine， Hangzhou， Zhejiang 310006）

AbstractIn the routine bacterial Gram-staining assay of microbiologic experimental teaching， the wrong staining results frequently occur due to the repeated use of bacterial cultures. In order to improve the teaching effect of bacterial Gramstaining assay， we established a modified Gram-staining method using 10% formalin-fixing bacterial suspensions. The stainingresultsoftheformalin-fixedsuspensionsstandingat4°Corroomtemperaturefor5or30dofStaphylococcusaureus， Bacillus subtilis and Escherichia coli using this modified method not only showed 100% correct rate， but also had the advantagessuchasuniformstaining，edgesharpnessandtypicalshapeofbacterialbodies，whichimprovedtheteachingeffect of Gram-stainingassay as well as decrease the work load of experimental preparation and usage of bacterial medium.

KeywordsMicrobiologic experimental teaching； modified Gram-staining method； Formalin； bacterial fixation

革蘭染色法是高等院校微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最為常用的細(xì)菌染色法，不僅可以輔助清晰地觀察細(xì)菌的形態(tài)，同時(shí)也能反映不同細(xì)菌細(xì)胞壁之間的差異并對(duì)臨床上抗生素的選擇具有參考價(jià)值。因此，醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中均將細(xì)菌革蘭染色法作為本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的基本內(nèi)容之一。然而，現(xiàn)行的革蘭染色法染色效果受到較多因素的干擾，包括細(xì)菌菌齡、細(xì)菌涂片厚度、乙醇脫色時(shí)間等的影響，導(dǎo)致最終染色出現(xiàn)假陰性、假陽性的結(jié)果，影響實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。其中在各種影響染色效果的因素中，菌齡對(duì)染色結(jié)果影響最大，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌染色結(jié)果正確性較高，幼齡或老齡菌染色后易出現(xiàn)假陰性或假陽性染色結(jié)果。[1]我國(guó)現(xiàn)行的實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系中，通常實(shí)驗(yàn)班級(jí)較多，故對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌往往保存于4°C冰箱貯存?zhèn)溆谩５形墨I(xiàn)報(bào)道，細(xì)菌在4°C時(shí)仍可緩慢生長(zhǎng)，故對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌長(zhǎng)時(shí)間4°C保存并反復(fù)使用后，已非處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從而影響革蘭染色結(jié)果的正確性。[2，3]

我們?cè)陂L(zhǎng)期的醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中發(fā)現(xiàn)，預(yù)先采用福爾馬林溶液固定待染色的細(xì)菌，可有效地消除菌齡對(duì)革蘭染色結(jié)果的影響，取得了良好的實(shí)驗(yàn)效果。接下來筆者就改良后的革蘭染色法進(jìn)行詳細(xì)的介紹，以期對(duì)同類實(shí)驗(yàn)教學(xué)的開展起到一定的借鑒作用。

1實(shí)驗(yàn)步驟與方法

菌種選擇及細(xì)菌培養(yǎng)：選擇金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌分別作為革蘭陽性球菌和桿菌、革蘭陰性桿菌代表。用火焰滅菌接種環(huán)挑取上述菌種接種于瓊脂平板或普通肉湯，37°C培養(yǎng)18 h，其中液體培養(yǎng)物定量OD600=1.0。

菌液制備及福爾馬林固定：上述用生理鹽水洗下的菌苔或細(xì)菌培養(yǎng)液2000r/min離心10min，取細(xì)菌沉淀懸于適量生理鹽水中，2000r/min離心10min，如此重復(fù)2-3次。部分離心獲得的細(xì)菌沉淀中加入適量10%福爾馬林溶液，混勻后室溫固定15min；將未用福爾馬林固定或福爾馬林固定的菌液在4°C或室溫下放置5或30 d，然后進(jìn)行革蘭染色。

改良革蘭染色法：將適量福爾馬林固定菌液滴加于潔凈載玻片上，用接種環(huán)涂布成直徑約10mm薄而均勻的菌膜，常規(guī)火焰固定；滴加結(jié)晶紫染液覆蓋菌膜，室溫染色1 min，細(xì)小水流沖洗數(shù)秒后甩干；滴加盧戈氏碘液覆蓋菌膜，室溫染色1 min，小水流沖洗數(shù)秒后甩干；滴加95%酒精覆蓋菌膜，輕輕旋轉(zhuǎn)或晃動(dòng)玻片，室溫脫色0.5min，小水流沖洗數(shù)秒后甩干；滴加石碳酸復(fù)紅染色液覆蓋菌膜，室溫染色1 min，小水流沖洗數(shù)秒后甩干，用吸水紙吸盡玻片上水份后用油鏡觀察。[4]

常規(guī)革蘭染色法：采用常規(guī)革蘭染色法染色對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期待染色菌種。[4]

細(xì)菌染色性判定：每種細(xì)菌與培養(yǎng)條件下均選取樣本數(shù)20，嚴(yán)格控制革蘭染色過程一致，染色結(jié)束后每張樣本撥片隨機(jī)選取3-5個(gè)單層細(xì)菌染色區(qū)進(jìn)行顯微鏡下觀察，藍(lán)紫色為革蘭陽性、紅色為革蘭陰性。根據(jù)鏡下染色結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果比對(duì)結(jié)果確定染色結(jié)果的正確率。

2結(jié)果與分析

2.1不同溫度及放置時(shí)間對(duì)常規(guī)革蘭染色結(jié)果的影響

新鮮培養(yǎng)（37°C培養(yǎng)18 h）后行常規(guī)革蘭染色的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌染色結(jié)果正確率均為100%；4°C冰箱放置5天后的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌培養(yǎng)物革蘭染色正確率分別為90%、70%和80%，20°C室溫放置5天后金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌革蘭染色正確率分別僅為60%和50%，枯草芽孢桿菌染色結(jié)果均轉(zhuǎn)為陰性，具體見表1。

在顯微鏡下觀察，革蘭染色結(jié)果錯(cuò)誤的金黃色葡萄球菌部分紫色紅色菌體參半，部分完全假陰性呈紅色；革蘭染色假陰性枯草芽孢桿菌著色變淺、不著色或呈紅色且菌體形態(tài)發(fā)生明顯變化，大部分菌體已出現(xiàn)芽孢；革蘭染色假陽性大腸埃希菌呈紫色且菌體變小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

革蘭染色結(jié)果的差異主要依據(jù)不同細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的不同，細(xì)菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，呈現(xiàn)典型的革蘭染色性。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入靜止期或衰亡期以后，隨著衰亡期細(xì)菌大量出現(xiàn)，菌體自溶現(xiàn)象的發(fā)生，細(xì)菌的菌體形態(tài)與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化，從而出現(xiàn)假性染色結(jié)果。不同溫度（4°C，20°C貯存條件）下，細(xì)菌呈現(xiàn)相對(duì)緩慢生長(zhǎng)，逐步進(jìn)入靜止期或衰亡期，所以不同溫度對(duì)染色結(jié)果的影響也是通過對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)的影響進(jìn)而影響染色結(jié)果。

2.2福爾馬林固定顯著增強(qiáng)染色結(jié)果穩(wěn)定性

采用10%福爾馬林固定細(xì)菌的改良革蘭染色法時(shí)，新鮮、室溫放置5或30d金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌液的染色結(jié)果正確率均為100%且呈現(xiàn)典型的菌體形態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

10%福爾馬林固定處理后，細(xì)菌菌體內(nèi)蛋白變性導(dǎo)致細(xì)胞死亡從而保持固有的菌體形態(tài)與結(jié)構(gòu)，行革蘭染色法鏡檢后，細(xì)胞形態(tài)與染色結(jié)果均穩(wěn)定，不受貯存溫度與貯存時(shí)間的影響，有效的解決了菌齡干擾染色結(jié)果的問題。

另一方面，10%福爾馬林固定處理后細(xì)菌菌液涂片相比于常規(guī)使用的斜面固體菌種涂片，更易于涂片均勻，出現(xiàn)單層分散菌體鏡像，對(duì)于初次接觸革蘭染色方法的學(xué)生實(shí)驗(yàn)成功率更高。

3討論

不同細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)存在顯著差異，一類細(xì)菌細(xì)胞壁由細(xì)菌胞漿膜和大量肽聚糖組成，另一類為細(xì)菌胞漿膜（也稱內(nèi)膜）、少量肽聚糖和外膜組成，這也是前者革蘭染色陽性、后者革蘭染色陰性的原因所在。[5]目前我國(guó)大多數(shù)高校微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系中，存在教學(xué)時(shí)間集中、學(xué)生人數(shù)龐大、實(shí)驗(yàn)教師編制有限等特點(diǎn)，細(xì)菌革蘭染色實(shí)驗(yàn)中通常無法及時(shí)培養(yǎng)和制備新鮮菌液，導(dǎo)致一次培養(yǎng)的細(xì)菌需在冰箱放置數(shù)天后使用，而不新鮮的菌液直接影響革蘭染色的結(jié)果，學(xué)生染色結(jié)果出現(xiàn)異?；蝈e(cuò)誤在我們的日常教學(xué)中時(shí)有發(fā)生。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4°C放置5天后分別有10%、30%和20%的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌液革蘭染色結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤，室溫放置5天后金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌常規(guī)革蘭染色結(jié)果的錯(cuò)誤率分別高達(dá)40%和50%，枯草芽孢桿菌染色結(jié)果甚至全部轉(zhuǎn)為陰性，同時(shí)還出現(xiàn)枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌出現(xiàn)不典型的菌體形態(tài)，不僅影響了實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，也易使學(xué)生實(shí)驗(yàn)成績(jī)?cè)u(píng)分出現(xiàn)誤判。因此，探索并建立穩(wěn)定可靠的細(xì)菌革蘭染色法在微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中具有較大實(shí)際意義。

福爾馬林是組織病理學(xué)檢查技術(shù)中常規(guī)使用的組織固定劑，可與組織及細(xì)胞中蛋白分子的氨基結(jié)合并使其固定化，從而有效地保持了組織及細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。[6]我們將福爾馬林組織固定的方法借鑒應(yīng)用到了細(xì)菌學(xué)中，研究結(jié)果顯示，采用10%福爾馬林固定細(xì)菌而制備的菌液，可在4°C或室溫放置30 d內(nèi)保持染色結(jié)果的正確性，同時(shí)還有菌體染色均勻、輪廓清晰、形態(tài)典型等優(yōu)點(diǎn)，不僅提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，同時(shí)大大減輕了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備的工作量并減少了培養(yǎng)基的使用量。室溫放置30 d是我們實(shí)驗(yàn)測(cè)試的放置時(shí)間，更久的室溫放置時(shí)間可以進(jìn)一步的進(jìn)行驗(yàn)證。此外，阿培脫染色法染色白喉棒狀桿菌實(shí)驗(yàn)也是病原微生物學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用染色方法，白喉棒狀桿菌的異染顆粒常因細(xì)菌多次傳代或培養(yǎng)物老化而使異染顆粒不明顯甚至消失，[7]從而影響染色結(jié)果。探索福爾馬林固定的白喉棒狀桿菌阿培脫染色能否顯示穩(wěn)定且典型的異染顆粒，值得我們后續(xù)進(jìn)一步的研究。

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