賈志鋒，馬 祥，琚澤亮，劉凱強，趙桂琴

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070；2.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點實驗室，青海 西寧 810016)

葉片不僅是光合作用的主要器官，同時也是植株與外界進行物質(zhì)和能量交換的紐帶[1-2]。葉片提前終止發(fā)育階段嚴重影響后期產(chǎn)量積累，有研究表明生物或非生物脅迫造成的作物葉片過早衰老，可使作物減產(chǎn)50%，在世界范圍內(nèi)是糧食減產(chǎn)的首要原因[3]。葉片衰老是葉片發(fā)育的最終階段，是一種程序性的細胞死亡，衰老是生物界普遍存在的一種現(xiàn)象[4-5]。衰老是葉片開始衰變的重要信號，其并不是一個被動的衰退過程[6]，一方面嚴格受基因調(diào)控[7]，另一方面也被生存環(huán)境所影響。Lohman等[8]研究擬南芥(Arabidopsisthaliana)發(fā)現(xiàn)，SAG系列基因與衰老相關，并證明SAG12基因與衰老高度特異；Xia等[9]在小麥(Triticumaestivum)葉片和葉鞘中鑒定出葉片衰老的負調(diào)控因子NAC1，該轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達可以延緩小麥葉片衰老速度，增加產(chǎn)量和籽粒蛋白含量。良好的生境延緩葉片衰老的發(fā)生和速度，甚至可以逆轉(zhuǎn)一些早期已經(jīng)衰老的表型，而逆境則加速衰老進程[10]。前人研究提出的激素平衡[11-12]、營養(yǎng)脅迫[13]和程序性細胞死亡[14]等理論較為合理的解釋了葉片衰老的機理，在此基礎上，學者們對葉片衰老本質(zhì)和延緩葉片衰老措施的研究也在不斷深入，對提升作物生產(chǎn)力具有重要意義。

優(yōu)化氮肥施量和種植密度是優(yōu)化群體結(jié)構、提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)的有效途徑[15]。在豐產(chǎn)栽培試驗中，通過管理措施調(diào)控延緩作物葉片在生殖生長階段的衰老速度，使之能持續(xù)不斷地向生殖器官輸送養(yǎng)分，是作物增產(chǎn)行之有效的手段之一[16]。氮素影響植物的代謝過程和生長發(fā)育，被認為是植物的生命元素[17]，過量施氮或氮肥不足都會引起營養(yǎng)體氮素再分配比率失衡，加速葉片的衰老，進而影響產(chǎn)量。Pommel等[28]研究發(fā)現(xiàn)，衰老速度不同的玉米(Zeamays)品種，在良好的氮肥環(huán)境能延緩早衰型玉米的穗下葉衰老速度，并且增加成熟期向種子轉(zhuǎn)移物質(zhì)的比率。增施氮肥改善小麥的產(chǎn)量構成，提高旗葉葉綠素含量、可溶性蛋白含量，提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性，減少膜脂過氧化和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)積累，使旗葉保持較長的綠葉期，增加生產(chǎn)潛力[18]。不同品種各生育期的綠葉面積和葉綠素含量受到氮肥施量的影響[19-20]，在一定范圍內(nèi)隨著種植密度的增加而提高，但種植密度進一步增加會縮短葉片功能期、降低葉片的光合性能，使其提前衰老，進而造成減產(chǎn)[21]，因此種植密度是影響葉片衰老的另一關鍵因素。

燕麥(Avenasativa)是我國高寒區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)廣泛種植的糧飼兼用型作物[22]，因其耐寒、耐瘠薄、抗逆性強、病蟲害少、抗雜類草等特點，在青藏高原地區(qū)得到大面積推廣，推動了該地區(qū)畜牧業(yè)的良性發(fā)展。燕麥營養(yǎng)價值豐富、莖葉柔嫩多汁、青刈飼料和青干草品質(zhì)優(yōu)異，是冬季牧場重要的補飼來源，對緩解冬季草場壓力和保護生態(tài)方面起著重要作用[23]。提高燕麥生產(chǎn)力有利于改善草畜矛盾、增加經(jīng)濟產(chǎn)出，而燕麥葉片衰老、過早進入失綠階段對產(chǎn)量增加影響極大。因此，本研究以青海省本地推廣品種‘青燕1號’為試驗對象，通過不同的栽培管理，探究氮肥施量與種植密度對燕麥衰老的影響，以維持燕麥較高的綠葉期，增加產(chǎn)出效益，為生產(chǎn)提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于青海省湟中縣上新莊村(101°37′ E，36°28′ N)，海拔2 620 m，氣候寒冷潮濕，無絕對無霜期，年均溫3.7℃，年平均降水量481 mm。試驗土地平整，質(zhì)地為栗鈣土，土壤全氮含量為1.4 g·kg-1，有效磷含量為22.2 mg·kg-1，速效鉀含量為98.5 mg·kg-1，pH值為7.9。前茬作物為蕎麥(FagopyrumesculentumM.)。

1.2 試驗材料

供試材料為‘青燕1號’(A.sativa‘Qingyan No.1’)，由青海省畜牧獸醫(yī)科學院種質(zhì)資源庫提供，為2015年收獲種子。

1.3 試驗設計

分別設置氮肥3個水平，0 kg·hm-2(N0)，90 kg·hm-2(N1)，180 kg·hm-2(N2)，氮肥品種為尿素(含N46%)；種植密度設3個水平，60 kg·hm-2(D1)，180 kg·hm-2(D2)，300 kg·hm-2(D3)。試驗共9個處理，3次重復，隨機區(qū)組排列。小區(qū)3 m×5 m，種植行距25 cm，小區(qū)間隔1 m，區(qū)組間隔1 m。

種植前進行了深耕滅茬、耙耱碎土、平整和鎮(zhèn)壓緊實等一系列作業(yè)，試驗于2016年4月23日條播種植。磷肥作為基肥在種植時一次施入。出苗后進行消除田間雜草及病蟲害防治等管理措施。除施氮肥外，每公頃施磷肥(P2O5)90 kg·hm-2，品種為過磷酸鈣(P2O512%)。

1.4 測定指標及方法

1.4.2切片制作 采用常規(guī)石蠟切片技術，并根據(jù)試驗具體情況加以改進。于開花期在每小區(qū)中間隨機挑選長勢一致的燕麥植株20株，采集旗葉供試。取葉片中段6～8 mm，F(xiàn)AA(甲醇:冰乙酸:70%乙醇= 1∶1∶18)固定液固定24 h，用酒精系列脫水，以95%伊紅酒精溶液替代95%酒精溶液，避免材料丟失，二甲苯逐級透明，54℃～56℃石蠟逐步浸蠟、包埋，Hestion自動輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(ERM 3000，常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司)切片，切片厚度為10 μm，40℃下展片，37℃充分烤片，再以番紅(30 min)-固綠(5 s)2重染色法染色。Olympus BX61正置萬能顯微鏡下觀察并拍照，Image-Pro Plus 5.0軟件對上、下表皮厚度、葉片厚度、主維管束面積、相鄰維管束間距進行測量，并對葉綠體數(shù)目進行統(tǒng)計。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)整理，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件進行方差分析、Duncan多重比較，采用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮肥和密度對燕麥葉片衰老特性的影響

不同氮肥和密度對燕麥葉片衰老指標的影響的方差分析見表1，氮肥、密度以及二者互作對各指標的影響均達到極顯著差異水平(P<0.01)。

表1 氮肥和密度對燕麥葉片衰老特性影響的方差分析Table 1 Variance analysis of effects of nitrogen and density on leaf senescence characteristic of oat

SOD，POD和CAT作為植物抗氧化系統(tǒng)的關鍵酶，其活性的大小經(jīng)常評價葉片生理狀況是否良好的重要參數(shù)，同一氮肥水平下，隨著種植密度增加，SP含量均以D3最低，分別為17.39，21.62和15.45 mg·g-1，說明高密度種植不利于SP的積累；SOD活性隨著種植密度增加在各氮肥水平下均不斷下降，種植密度對其影響明顯；POD活性在N0和N1水平下隨種植密度增加無顯著差異，但在N2水平下有明顯下降趨勢；CAT活性整體隨種植密度增加先增后減，分別以D2密度水平最高，D3最低。

同一種植密度下，SP在D1密度下隨施氮量顯著增加，在D2和D3密度下隨氮肥增加先增后減，以N1水平最高；SOD活性隨著施氮量增加，在D1和D2水平下以N1施肥量最高，在D3水平下以N1和N2施肥量最高；POD活性在D1，D2和D3水平下隨施氮量的增加先增后降，且D2和D3水平下N2施肥量POD活性顯著低于N1施肥量；CAT活性在D1和D2水平下隨著隨施氮量增加而增加，在D3水平下隨施氮量增加而減小。

綜上可得，高氮密植會增加燕麥葉片的氧化脅迫程度，降低抗氧化酶及可溶性蛋白的活性和含量，加速葉片的衰老，因此，適當?shù)氖┑秃侠淼姆N植密度是保持葉片良好的生理狀態(tài)、提高產(chǎn)量的重要手段。

圖1 氮肥和密度對燕麥葉片衰老指標的影響Fig.1 Effects of nitrogen and plant density on leaf senescence index of oat注：不同大寫字母表示同一氮肥水平下各種植密度間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一種植密度下各氮肥水平間差異顯著(P<0.05)；N0，N1和N2分別表示0，90和180 kg·hm-2的施氮量，D1，D2和D3分別表示60，180和300 kg·hm-2的播種量。下同Note:Different capital letters indicated significant differences among different plant density under the same level of nitrogen (P<0.05);different lowercase letters indicated significant differences among different levels of nitrogen under the same plant density (P< 0.05);N0,N1 and N2 represent nitrogen fertilizer rates at five levels of 0,90 and 180 kg·hm-2,respectively,D1,D2 and D3 represent sowing rate at three levels of 60,180,and 300 kg·hm-2,respectively. The same as below

2.2 燕麥葉片顯微結(jié)構變化

燕麥葉片為等面葉，結(jié)構比較簡單，主要由3部分組成，分別是表皮、葉肉和葉脈(圖2)。葉片的上、下表皮各由一層細胞組成，細胞較小且排列緊密。上表皮不同于下表皮，其上分布有泡狀細胞，呈水滴狀，不含葉綠體。葉肉組織也比較簡單，由4～6層葉肉細胞及圍繞著維管束排列的薄壁細胞組成，含有葉綠體。葉脈由一個大的主脈維管束和若干小維管束共同組成，起支撐作用，穿插分布于葉肉細胞內(nèi)，是燕麥葉片的骨架部分。維管束鞘細胞由1～2層薄壁細胞組成，不含或很少葉綠體，沒有與葉肉細胞組成C4植物特有的花環(huán)結(jié)構，因此，葉片解剖結(jié)構顯示燕麥屬于C3植物。

不同氮肥和密度對燕麥葉片細胞結(jié)構的影響的方差分析見表2，氮肥處理下上表皮厚度、下表皮厚度、葉片厚度、主維管束面積、相鄰維管束間距和葉綠體數(shù)量均達顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平；密度處理下除葉片厚度外，其余指標均達極顯著(P<0.01)差異水平；而氮肥和密度二者互作僅在葉片厚度、主維管束面積、相鄰維管束間距和葉綠體數(shù)量達到極顯著差異(P<0.01)。

圖2 燕麥葉片解剖結(jié)構Fig.2 Anatomical structure of leaf in oat注：A：葉尖；B：葉片中部；C：葉脈；ue：上表皮；le：下表皮；mc：葉肉細胞；bc：泡狀細胞；gc：保衛(wèi)細胞；st：氣孔；ac：孔下室；ch：葉綠體；vb：維管束；xy：木質(zhì)部；ph：韌皮部；mt：機械組織。下同Note:A:Leaf apex；B:Middle part of leaf；C:Vein；ue:Upper epidermis；le:Lower epidermis；mc:Mesophyll cell；bc:Bulliform cell；gc:Guard cell；st:Stomata；ac:Air cavity；ch:Chloroplast；vb:Vascular bundle；xy:Xylem；ph:Phloem；mt:Mechanical tissue. the same as below

2.2.1葉片上表皮厚度變化 施氮后隨著種植密度的變化，燕麥葉片上表皮厚度在N0和N1水平下無明顯差異(表3)，但在N2水平下隨著種植密度的增加上表皮厚度下降顯著(P<0.05)。在同一種植密度下，隨著氮肥施量增加，上表皮厚度總體呈現(xiàn)增加的趨勢，其中以N2D1處理最高，說明增施氮肥和疏植對上表皮細胞發(fā)育具有一定的促進作用。

2.2.2葉片下表皮厚度變化 氮肥和密度配置對燕麥葉片下表皮厚度的影響變化與上表皮厚度相似，N0和N1施量對各種植密度下葉片的下表皮厚度無顯著影響，施氮量增至N2水平后，隨著種植密度增加葉片下表皮厚度開始下降；在D1和D2密度下，施氮(N1和N2)較不施氮(N0)葉片下表皮厚度增加了1.2～3.4 μm，但在D3密度下氮肥增施對下表皮厚度無顯著影響。

表2 氮肥和密度對燕麥葉片細胞結(jié)構影響的方差分析Table 2 Variance analysis of effects of nitrogen and density on cell structure of leaf in oat

2.2.3葉片厚度變化 施氮后燕麥葉片厚度隨種植密度增加變化各異，以N1D1處理最高(257.2 μm)，其次為N0D3處理(254.8 μm)，葉片厚度受施氮量和種植密度影響較大，不同施氮量與密度組合對葉片厚度影響差異較大，尤其在D2和D3密度下，隨著施氮量增加葉片厚度變化趨勢相反。

2.2.4葉片主維管束面積變化 氮肥和種植密度對葉片主維管束面積大小影響顯著(P<0.05)，且不同施氮和種植密度組合影響程度不同。施氮肥后隨著種植密度增加主維管束面積不斷降低，且均以D3種植密度最低；在相同種植密度下隨著氮肥施量提高，主維管束面積呈增加趨勢。不同氮肥和密度處理下以N2D1處理最高，較最低處理N0D3高2.66倍，因此低氮密植不利于主維管束面積增加。

2.2.5葉片相鄰維管束間距變化 隨著種植密度增加，各施氮量下葉片相鄰維管束間距變化不同，在N0和N2水平下，種植密度增加會減小葉片相鄰維管束間距，而在N1水平下無顯著影響；在相同種植密度下，除D2密度無明顯變化外，氮肥施量增加增加了相鄰維管束間距。

2.2.6葉片葉綠體數(shù)量變化 氮肥和種植密度改變后，葉綠體數(shù)量發(fā)生顯著變化(P<0.05)，單位面積葉綠體數(shù)量變化在7.0～18.3個之間。在相同施氮量下增加種植密度會減少葉綠體的數(shù)量，在同一種植密度下增施氮肥能緩解密度對葉綠體數(shù)量的抑制效應。

2.3 氮肥和密度對燕麥葉片解剖結(jié)構的影響

不同氮肥和種植密度水平下燕麥葉片解剖結(jié)構變化見圖3，氮肥和種植密度的改變影響了葉片組織結(jié)構發(fā)育。從圖中可以看出，施氮后隨著種植密度增加，燕麥葉片的葉綠體數(shù)量下降明顯，機械組織細胞數(shù)量明顯減少，木質(zhì)化程度降低，孔下室數(shù)量降低，導致葉片的通氣能力下降，木質(zhì)部導管面積和數(shù)量減小，疏導能力下降。由圖3可知，在同一種植密度下，增施氮肥能緩解上述不良效應，隨著氮肥施量的增加，燕麥葉片的葉綠體數(shù)量、機械組織和疏導組織大小均有不同程度提高，可見氮肥在一定程度上能緩解密度增加帶來的抑制效應。

表3 氮肥和密度對燕麥葉片顯微結(jié)構的影響Table 3 Variance analysis of effects of nitrogen and density on leaf microstructure of oat

圖3 氮肥和密度對燕麥葉片解剖結(jié)構的影響Fig.3 Effects nitrogen and density on anatomical structure of leaf in oat

3 討論

植物在葉片結(jié)構特征上的改變是對環(huán)境的適應性表現(xiàn)，葉片結(jié)構的差異與抗逆性和抗病能力密切相關[36-37]。外界環(huán)境的改變會引起植物葉片厚度、表皮細胞大小的改變。上表皮的厚度可以調(diào)節(jié)葉片表觀量子效率，一方面上表皮層可以避免強光對葉肉細胞的灼傷，另一方面可以影響光量子的反射途徑從而增加葉片內(nèi)部光量子的密度[38]。因此，葉片厚度和上表皮厚度可以調(diào)節(jié)葉片內(nèi)部水分平衡，更好的吸收漫射光和散射光，提高光能的截獲效率[39]。本試驗中，施氮肥后隨著種植密度增加，葉片上表皮和下表皮厚度僅在180 kg·hm-2的施氮量下表現(xiàn)出差異，而相同種植密度下，施氮量增加提高了上表皮和下表皮厚度，可見氮肥對上下表皮厚度影響更大；葉片厚度受氮肥和密度互作影響顯著，高密度種植下施氮量增加會使葉片變薄，這會造成葉片的儲水能力下降、蒸騰效率降低，進而影響光能利用。一般而言，維管束面積、數(shù)目與植物對養(yǎng)分吸收的能力成正比[40]。維管束數(shù)量減少，水分運送效率就會降低，碳水化合物及礦物質(zhì)不能及時運送到植物各個器官，進而導致機體代謝變緩，葉片合成及輸送營養(yǎng)物質(zhì)的能力下降，逐漸進入衰老階段，這也是大多數(shù)植物生長后期葉片開始大量衰老脫落的重要原因。本試驗中，低氮密植有利于減小相鄰維管束間距，增加單位面積的維管束數(shù)量，而高氮疏植會增加主維管束面積，因此，在盡可能增加維管束面積的同時，增加單位面積的維管束數(shù)量，需要合理的氮肥和密度配置。

葉綠體是植物進行光合同化的關鍵器官，葉綠體的數(shù)量決定了葉片光合速率的上限，F(xiàn)ord等[41]認為衰老過程通常分為兩個階段，首先是葉綠體功能下降，其次是葉綠體含量下降和喪失的短暫終末期，而Inada等[42]認為只有在葉片的衰老后期才會發(fā)生葉綠體數(shù)量的改變。本試驗中，低種植密度下各施氮水平均保持較高的葉綠體數(shù)量，密度對葉綠體數(shù)量的影響高于其他因素，因此，低密度種植有利于增加葉片的光合效率，延緩衰老。

4 結(jié)論