楊 航，祁 娟，劉文輝，劉艷君，宿敬龍，李 明

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，甘肅 蘭州 730070；2. 青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

自毒作用是導(dǎo)致連作障礙的主要因素之一[1]。植物在生長(zhǎng)過程中，通過根系向土壤中釋放一些有毒物質(zhì)抑制自身或種內(nèi)植物生長(zhǎng)發(fā)育[2]，這些物質(zhì)包括有機(jī)酸類、脂類、烴類、苯類等[3]。研究表明，蘭州百合(Liliumdavidiivar. unicolor salisd)根系分泌物中鑒定出棕櫚酸、抗氧化劑2246和高根二醇等物質(zhì)[4]，且不同連作年限根際土壤浸提液會(huì)抑制百合幼苗的生長(zhǎng)[5]；不同種植年限的紫花苜蓿(MedicagosativaL.)土壤中自毒物質(zhì)的種類與含量有顯著差異，且其水浸提液會(huì)對(duì)其種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用[6,7]。馬瑞霞等[8]利用氣質(zhì)聯(lián)用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技術(shù)從小麥(TriticumaestivumL.)殘?bào)w中分離出酚酸類化感物質(zhì)，亦對(duì)其種子萌發(fā)產(chǎn)生明顯的抑制效果；聶銘[9]研究表明，種植地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)土壤中自毒物質(zhì)含量隨著種植年限的增長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。

近年來，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，飼草料缺乏問題日益顯著，人工草地建植是解決畜牧業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵途徑[10]。老芒麥(ElymussibiricusL.)是禾本科披堿草屬多年生牧草，具有抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)草量高、適口性好等特點(diǎn)[11]，常用于人工草地的建植和退化草地的修復(fù)。但多年的實(shí)踐證明，老芒麥的利用年限較短，有研究表明，披堿草屬人工草地在建植第4年以后開始衰退，在封育條件下，種群生產(chǎn)力在第4年也會(huì)開始下降，第7年嚴(yán)重退化[12]，有研究表明連作會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)，致使植物生產(chǎn)力下降[13]。目前，關(guān)于調(diào)控老芒麥種群易衰退的主要因子研究偶見報(bào)道[14-16]，但關(guān)于連作障礙對(duì)老芒麥生長(zhǎng)的影響研究鮮見報(bào)道。為此，本研究以不同種植年限‘青牧一號(hào)’老芒麥根際土壤為研究對(duì)象，通過GC-MS檢測(cè)方法，分析老芒麥根際土壤中脂肪酸酯類物質(zhì)的種類與含量變化規(guī)律，并進(jìn)一步研究不同年限土壤浸提液對(duì)老芒麥種子萌發(fā)的影響，以明確連作障礙與自毒效應(yīng)是否為影響老芒麥生長(zhǎng)發(fā)育的因素之一，旨在避免自毒效應(yīng)給老芒麥人工草地建植帶來損失，同時(shí)為老芒麥人工草地建植提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概括

試驗(yàn)地位于青海省海北州海晏縣國家草品種區(qū)域試驗(yàn)中心，坐標(biāo)為100°85′E，36°45′N，平均海拔3 154 m。寒冷期長(zhǎng)，無絕對(duì)霜期，最高氣溫31℃，最低氣溫-33℃，年均溫0.6℃。年降水量集中在7，8，9月份，為369～403 mm，全年干濕季節(jié)分明，雨熱同期，年均蒸發(fā)量在1 435 mm左右，無霜期約90 d。

1.2 根際土壤采集

于2019年9月初，在已建植3年、4年、5年和8年的‘青牧一號(hào)’老芒麥人工草地中分別挖取長(zhǎng)勢(shì)均勻的老芒麥根系，參照盧豪良等[17]方法，先抖落表面土壤，后用毛刷輕輕刷掉根表面大約5 mm的土壤，裝入密封袋，寫明標(biāo)簽，帶回實(shí)驗(yàn)室冷藏保存。

1.3 脂肪酸提取

將所采集到的4種年限土壤晾干后研磨過0.25 mm篩，然后稱取0.5 g至10 mL的離心管中，每個(gè)年限做3次重復(fù)，進(jìn)行以下操作。

(1)每個(gè)離心管中加入5 mL的色譜甲醇浸泡2小時(shí)，10 000 r·min-1離心10 min，提取2次合并上清液。

(2)再加入5 mL的三氯甲烷混勻后浸泡2小時(shí)，10 000 r·min-1離心10 min，用注射器過濾，提取2次合并上清液。

(3)將步驟(1)(2)中的提取液各取2.5 mL至離心管中混勻，用氮吹儀吹干。

(4)在經(jīng)過氮吹儀的離心管中加入5%氫氧化鉀-甲醇溶液1 mL，搖勻，在60℃水浴加熱30 min，取出冷卻至室溫。

(5)后加入3 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，搖勻，在60℃水浴加熱3 min，取出冷卻至室溫。

(6)最后加入2 mL正己烷，充分振蕩，靜置，取上清液于GC-MS分析。

1.4 GC-MS分析條件

氣象色譜儀：安捷倫7890A-5975CMS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。安捷倫毛細(xì)管DB-225 ms(規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm)。進(jìn)樣口溫度：280℃，分流比 20：1；升溫程序：初始溫度為50℃，保持5℃·min-1升溫至 200℃，再以2℃·min-1升溫至230℃，保持10 min。載氣：He，載氣流量：1 mL·min-1；進(jìn)樣量1 μL。離子源溫度為230℃，四級(jí)桿溫度150℃，電離方式EI，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍為35～800 μ。

1.5 土壤浸提液制備

將所采集到的已種植老芒麥3，4，5和8年的根際土壤晾干后研磨過0.25 mm篩，分別稱取5，10，20和50 g各年限根際土壤置于三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，用保鮮膜封口，在30℃的超聲波中萃取30 min，然后在25℃，150 r·min-1的條件下震蕩浸提24 h，振蕩完后過濾浸提液，最后將浸提液定容為100 mL，各年限根際土壤分別配置成50，100，200，500 g·L-1浸提液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 種子發(fā)芽試驗(yàn)與測(cè)定指標(biāo)

選取大小一致、飽滿無病害的‘青牧一號(hào)’老芒麥種子，用78%的酒精浸泡1 min，然后用蒸餾水沖洗至無酒精味，用濾紙吸干表面水分。采用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽法，在直徑為9 cm的一次性培養(yǎng)皿中鋪雙層濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻擺放30粒老芒麥種子，加入上一步制備的土壤浸提液5 mL，共16個(gè)處理，3次重復(fù)。培養(yǎng)皿蓋上蓋子，置于溫度為25℃，光強(qiáng)6 000 lx，相對(duì)濕度75%，光周期14 h，暗周期10 h的光照培養(yǎng)箱中，每天補(bǔ)充適量根際土壤浸提液保證濾紙濕潤(rùn)。

測(cè)定指標(biāo)：參考祁娟等[18]方法，以胚根伸出種皮2 mm作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，在發(fā)芽第5天測(cè)定發(fā)芽勢(shì)，第12天測(cè)定種子發(fā)芽率，同時(shí)，每個(gè)處理隨機(jī)選取10株幼苗，在坐標(biāo)紙上測(cè)定胚芽和胚根長(zhǎng)。用以下方法計(jì)算不同處理的種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率。

發(fā)芽勢(shì)=發(fā)芽試驗(yàn)5天內(nèi)供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽率=發(fā)芽試驗(yàn)12天內(nèi)供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0軟件對(duì)老芒麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性比較(P<0.05)，并對(duì)年限、濃度及其互作效應(yīng)進(jìn)行雙因素分析，利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行綜合處理和繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 不同種植年限老芒麥根際土壤脂肪酸酯類物質(zhì)的檢測(cè)

對(duì)不同種植年限老芒麥根際土壤采用正丁烷提取法，提取物通過GC-MS分析，得到總離子流圖(圖1)，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖對(duì)比，若兩者匹配度大于95%，即可鑒定出此物質(zhì)。根據(jù)總離子流圖，分析得到4種不同年限土壤的脂肪酸酯類物質(zhì)含量(表1)。結(jié)果顯示，4個(gè)不同年限的根際土壤中均檢測(cè)出10種物質(zhì)。就脂肪酸酯類物質(zhì)總量而言，5齡老芒麥的根際土壤中相對(duì)含量較高，為50%，8齡中較低，為41%，3和4齡根際土壤中脂肪酸酯類物質(zhì)總量分別為48%和45%。

硬脂酸甲酯是4個(gè)不同年限土壤中占比最大的物質(zhì)，分別占3，4，5和8齡土壤中脂肪酸酯類總量的39%，42%，42%和41%，棕櫚酸甲酯占脂肪酸酯類物質(zhì)總量的29%，33%，31%和32%。3齡的根際土壤中，棕櫚油酸甲酯、亞油酸甲酯和r-亞麻酸甲酯顯著高于其他3個(gè)年限土壤(P<0.05)，其中，棕櫚油酸甲酯較4，5和8齡土壤分別高出98%，62%和58%，亞油酸甲酯分別高出47%，17%和75%，r-亞麻酸甲酯分別高出51%，127%和217%。棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯含量會(huì)隨著種植年限的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且都在5齡的時(shí)候達(dá)到較大值，其棕櫚酸甲酯含量顯著高于8齡土壤(P<0.05)，較8齡土壤高出17%，硬脂酸甲酯含量較3，4和8齡土壤分別高出12%，10%和23%(P<0.05)。

2.2 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對(duì)其種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1不同年限老芒麥土壤浸提液對(duì)其種子發(fā)芽率的影響 由圖2可知，不同年限土壤浸提液與不同濃度浸提液處理會(huì)對(duì)老芒麥種子發(fā)芽率造成不同的影響，3齡老芒麥根際土壤浸提液在200 g·L-1的濃度下發(fā)芽率較高，為69%，在5齡且濃度為500 g·L-1的浸提液處理下發(fā)芽率較低，僅為45%；4齡老芒麥根際土壤浸提液下，發(fā)芽率會(huì)隨著浸提液濃度的升高而先升高后下降，且500 g·L-1濃度下顯著低于其他3個(gè)處理(P<0.05)；5齡老芒麥根際土壤浸提液處理下，發(fā)芽率隨著浸提液濃度的升高而下降，50 g·L-1處理下顯著高于200和500 g·L-1(P<0.05)，較100，200和500 g·L-1處理下發(fā)芽率分別提高了6%，27%和44%；在8齡老芒麥根際土壤浸提液處理下，發(fā)芽率同樣隨著浸提液濃度升高而下降，200和500 g·L-1濃度處理下顯著低于50 g·L-1處理(P<0.05)，較50 g·L-1處理分別降低了17%和24%。在浸提液濃度為200 g·L-1處理下，發(fā)芽率會(huì)隨著年限的增長(zhǎng)而下降，3齡和4齡老芒麥根際土壤浸提液處理下顯著高于5齡和8齡(P<0.05)。

圖1 不同種植年限老芒麥根際土壤脂肪酸酯類物質(zhì)GC-MS色譜圖Fig.1 GC-MS map of fatty acid lipids in soil of rhizosphere soil of Elymus sibiricus L.in different planting years

表1 不同種植年限老芒麥根際土壤中脂肪酸酯類物質(zhì)的相對(duì)含量Table 1 Relative contents of fatty acids and lipids in rhizosphere soil of Elymus sibiricus L. in different planting years

圖2 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對(duì)其種子發(fā)芽率的影響Fig. 2 Effects of soil extracts on seed germination rate of Elymus sibiricus L. in different planting years注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments at the 0.05 level,the same as below

2.2.2不同年限土壤浸提液對(duì)老芒麥種子發(fā)芽勢(shì)的影響 由圖3可知，3齡老芒麥根際土壤浸提液在50 g·L-1濃度下發(fā)芽勢(shì)較高，為49%，5齡老芒麥根際土壤浸提液在500 g·L-1的濃度處理下發(fā)芽勢(shì)較低，值為30%。在5齡和8齡根際土壤浸提液處理下，老芒麥種子發(fā)芽勢(shì)會(huì)隨著土壤浸提液濃度的升高而呈下降趨勢(shì)，且5齡老芒麥根際土壤在200 g·L-1和500 g·L-1處理下種子發(fā)芽勢(shì)顯著低于同齡50 g·L-1浸提液處理，分別降低了32%和37%(P<0.05)。土壤浸提液濃度為50 g·L-1時(shí)，3齡老芒麥根際土壤浸提液處理下種子發(fā)芽勢(shì)較8齡提高了29%(P<0.05)；在200 g·L-1濃度下，老芒麥種子的發(fā)芽勢(shì)隨年限增長(zhǎng)呈現(xiàn)出先降低后升高的規(guī)律，在5齡時(shí)最低，較3和4齡分別降低了26%和24%(P<0.05)。

圖3 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對(duì)其種子發(fā)芽勢(shì)的影響Fig.3 Effects of soil extracts on seed germination potential of Elymus sibiricus L. in different planting years

2.2.3不同年限土壤浸提液對(duì)老芒麥胚芽長(zhǎng)的影響 由圖4可知，不同濃度與不同年限的土壤浸提液會(huì)影響老芒麥胚芽生長(zhǎng)。4齡老芒麥根際土壤浸提液在100 g·L-1的濃度處理下老芒麥胚芽較長(zhǎng)，達(dá)到5.6 cm，胚芽長(zhǎng)在50 g·L-1的8齡老芒麥根際土壤浸提液處理下較短，為4.5 cm；3齡老芒麥根際土壤浸提液處理中，胚芽長(zhǎng)隨濃度升高先下降后升高，200 g·L-1濃度處理下較50，100和500 g·L-1處理分別降低了21%，15%和10%；在4齡老芒麥根際土壤浸提液處理中，胚芽長(zhǎng)隨濃度升高先升高后降低，500 g·L-1濃度處理較100 g·L-1濃度處理下降低了16%(P<0.05)。在浸提液濃度為200 g·L-1的處理下，老芒麥胚芽長(zhǎng)度會(huì)隨著年限增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，3齡根際土壤浸提液處理顯著低于4，5和8齡，而在500 g·L-1濃度處理下，隨著年限的增長(zhǎng)，胚芽長(zhǎng)度降低。

圖4 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對(duì)其幼苗胚芽長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of soil extracts on germ length of Elymus sibiricus L. in different planting years

2.2.4不同年限土壤浸提液對(duì)老芒麥胚根長(zhǎng)的影響 由圖5可知，3齡老芒麥根際土壤浸提液處理下，老芒麥幼苗胚根長(zhǎng)會(huì)隨著濃度的升高而下降，胚根長(zhǎng)在500 g·L-1濃度處理下較其他3個(gè)濃度分別降低了28%，21%和17%(P<0.05)；8齡老芒麥根際土壤浸提液處理下，幼苗胚根長(zhǎng)同樣隨著濃度升高而降低，濃度為500 g·L-1處理時(shí)，老芒麥胚根長(zhǎng)較短，為2.7 cm，較50 g·L-1和100 g·L-1的濃度處理分別降低了25%和20%(P<0.05)。在浸提液濃度為100 g·L-1的處理下，老芒麥幼苗胚根長(zhǎng)會(huì)隨著年限的增長(zhǎng)先降低后升高，在5齡根際土壤浸提液處理下較低，當(dāng)浸提液濃度為200 g·L-1時(shí)，胚根長(zhǎng)會(huì)隨著年限增長(zhǎng)而下降。

圖5 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對(duì)其幼苗胚根長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of soil extracts on radicle length of Elymus sibiricus L. in different planting years

2.3 浸提液不同年限、濃度及其互作對(duì)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)影響的方差分析

表2雙因素方差分析結(jié)果顯示，年限與浸提液濃度對(duì)老芒麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、胚芽長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生顯著或極顯著影響，年限對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)與胚根長(zhǎng)的影響不顯著，對(duì)發(fā)芽率影響極顯著(P<0.01)，對(duì)胚芽長(zhǎng)影響顯著(P<0.05)。而浸提液濃度對(duì)種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)均存在極顯著影響(P<0.01)，而浸提液年限與濃度的交互作用對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和胚芽長(zhǎng)影響極顯著(P<0.01)，對(duì)胚根長(zhǎng)無顯著影響。

表2 年限、濃度及其互作對(duì)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)影響的方差分析Table 2 Results of two-way ANONA of characteristics by years,concentrations and their interactions on seed germination and seedling growth

3 討論

3.1 不同種植年限老芒麥根際土壤脂肪酸酯類物質(zhì)含量變化

脂肪酸是根系分泌物的主要物質(zhì)之一[19-20]，在許多植物中存在著多種脂肪酸類物質(zhì)，并且植物連作年限會(huì)影響其物質(zhì)的分泌和積累[21]，進(jìn)而影響連作種植下自毒程度的強(qiáng)弱。鄭陽霞等[22]研究表明，脂肪酸酯類物質(zhì)會(huì)破壞西瓜幼苗的抗氧化系統(tǒng)，抑制幼苗的生長(zhǎng)。本研究表明，種植老芒麥年限不同，其根際土壤中脂肪酸酯類物質(zhì)含量存在差異，且棕櫚酸甲酯、十七烷酸甲酯和硬脂酸甲酯含量隨年限的升高呈現(xiàn)先升高后下降的規(guī)律，均在5齡時(shí)最高，這可能是老芒麥經(jīng)過5年的種植后，植株內(nèi)部生理代謝系統(tǒng)發(fā)生了改變，導(dǎo)致不同年限老芒麥分泌的化感物質(zhì)含量具有差異，導(dǎo)致在第8年生長(zhǎng)時(shí)，根系分泌的物質(zhì)組分與含量發(fā)生變化；本研究結(jié)果還表明，5齡根際土壤中脂肪酸酯類物質(zhì)的總含量是最高的，而在種植了8年的根際土壤中脂肪酸酯類物質(zhì)總含量有所下降，說明老芒麥在多年的建植過程中，可能隨著年限的增長(zhǎng)，土壤中脂肪酸酯類物質(zhì)的積累會(huì)達(dá)到一個(gè)峰值，從而影響老芒麥生長(zhǎng)發(fā)育，使其根系分泌物減少，并結(jié)合土壤自身的緩沖性[23]，使第8年時(shí)土壤中脂肪酸酯類物質(zhì)含量較低。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)自毒物質(zhì)的積累超過某個(gè)閾值，便會(huì)產(chǎn)生自毒效應(yīng)使植株生長(zhǎng)受阻，導(dǎo)致根系分泌物的種類和數(shù)量相對(duì)減少[24-25]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。

3.2 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對(duì)其種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

種子萌發(fā)期是植物生長(zhǎng)的首要階段，萌發(fā)期會(huì)對(duì)外界環(huán)境產(chǎn)生最敏感的響應(yīng)，而且種子萌發(fā)會(huì)影響植株的出苗率和種群數(shù)量，幼苗則會(huì)直接影響植株的產(chǎn)量和品質(zhì)[26]。楊倩等[27]在異齡苜蓿土壤浸提液對(duì)3種植物種子萌發(fā)的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，5齡苜蓿根際土壤浸提液對(duì)其種子萌發(fā)的抑制作用強(qiáng)于3齡和9齡土壤；王英等[28]研究表明，不同濃度伊貝母根際土壤浸提液對(duì)其種子萌發(fā)存在濃度效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，老芒麥種子萌發(fā)在不同年限和不同濃度老芒麥根際土壤浸提液下表現(xiàn)存在差異。在不同年限下，低濃度的根際土壤浸提液對(duì)老芒麥種子萌發(fā)、胚芽長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制效果不明顯，表明了自毒物質(zhì)可能要積累到一定的濃度水平才會(huì)產(chǎn)生抑制作用，這與胡躍高等[29]在苜蓿的自毒性研究中得到的結(jié)果相似。在5齡和8齡的根際土壤浸提液處理下，隨著浸提液濃度升高，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和胚根長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)，而胚芽長(zhǎng)沒有呈現(xiàn)這一趨勢(shì)，一方面說明老芒麥不同部位對(duì)自毒物質(zhì)響應(yīng)有差異，另一方面也說明了老芒麥種植年限與浸提液濃度都是影響老芒麥種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的因素，這與張新慧等[30]在當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv.) Diels)根際土壤水浸液的自毒作用研究及化感物質(zhì)的鑒定試驗(yàn)中的研究結(jié)果相一致。在本試驗(yàn)中，浸提液濃度為200 g·L-1和500 g·L-1時(shí)，5齡根際土壤浸提液對(duì)種子發(fā)芽抑制作用最強(qiáng)，而8齡時(shí)抑制作用又有所減弱，這可能是因?yàn)槔厦Ⅺ溤诜N植2～4年期間植株生命力最旺盛，分泌的根系分泌物較多，在第5年時(shí)自毒效應(yīng)反饋到老芒麥生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，導(dǎo)致根的發(fā)育受到抑制，根系分泌物從源頭上減少，到第8年時(shí)根系分泌物被土壤自我調(diào)節(jié)或者對(duì)周圍雜草產(chǎn)生化感效應(yīng)而吸收，從而種植老芒麥8年的土壤浸提液對(duì)種子發(fā)芽的抑制作用低于5年土壤。王希[31]在黃土高原紫花苜蓿自毒效應(yīng)的初步研究中同樣發(fā)現(xiàn)，種植紫花苜蓿5年的土壤浸提液處理其種子，發(fā)芽率低于種植紫花苜蓿9年的土壤浸提液處理，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。

從雙因素方差分析可知，年限、濃度和年限與濃度的交互作用都會(huì)影響種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，表明老芒麥隨著種植年限的增長(zhǎng)，自毒物質(zhì)在土壤中滯留、轉(zhuǎn)化，在積累到一定濃度后，會(huì)制約老芒麥生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致老芒麥人工草地補(bǔ)播效果不明顯。李玉占等[32]研究表明，苜蓿在5年后生產(chǎn)力下降，在間隔時(shí)間短的情況下，補(bǔ)播很難成功，其自毒效應(yīng)可能是主要原因之一，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。

綜上，不同種植年限老芒麥土壤浸提液存在自毒作用，在5齡時(shí)表現(xiàn)突出。因此，可以推斷老芒麥很可能存在連作障礙，并且自毒作用是連作障礙的主要原因之一，而自毒物質(zhì)除了脂肪酸酯類物質(zhì)，可能還存在成百上千種，這有待于更進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究表明，5齡老芒麥根際土壤中脂肪酸酯類物質(zhì)的相對(duì)總含量較高，為50%；5和8齡老芒麥根際土壤浸提液對(duì)其種子發(fā)芽率具有明顯的“低促高抑”濃度效應(yīng)；在浸提液濃度為200 g·L-1時(shí)，年限增長(zhǎng)與胚根長(zhǎng)生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)；年限對(duì)種子發(fā)芽率影響極顯著，對(duì)胚芽長(zhǎng)影響較顯著。因此推測(cè)，老芒麥逐漸衰退與自毒作用導(dǎo)致的連作障礙有密切的關(guān)系，怎樣減弱自毒物質(zhì)的毒害進(jìn)而延緩老芒麥退化需要進(jìn)一步研究。