孔曉飛

2008年，12歲的Elana Simon被診斷為一種罕見的肝臟腫瘤——纖維板層型肝細(xì)胞癌(FL-HCC)，這是一種好發(fā)于年輕人的惡性肝臟腫瘤，部分患者因出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、沒有有效治療的方法而死亡[1]。Elana在紐約斯隆腫瘤中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)完成肝臟腫瘤切除手術(shù)，而她的父親Sanford Simons是一位國際著名的細(xì)胞生物學(xué)家，研究細(xì)胞內(nèi)不同囊泡之間的蛋白轉(zhuǎn)運，因為女兒的疾病轉(zhuǎn)而開始研究一個全新方向——纖維板層型肝細(xì)胞癌。他采用全外顯子測序和腫瘤細(xì)胞核糖核酸測序(RNA-Seq)技術(shù)對15例類似患者的腫瘤進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)所有患者遺傳學(xué)上存在基因缺失的共同特點，兩個相鄰的基因DNAJB1和PRKACA之間一段DNA序列消失，在mRNA水平DNAJB1和PRKACA之間形成一種嵌合狀態(tài)。PRKACA在正常肝細(xì)胞中處于低表達(dá)狀態(tài)，而由于其固有基因調(diào)控區(qū)域的缺失，PRKACA受到DNAJB1的啟動子調(diào)節(jié)，導(dǎo)致嵌合的PRKACA基因過度表達(dá)，而PRKACA基因編碼一個具備激酶活性的蛋白，引起癌變。Elana作為一名高中生，學(xué)習(xí)之余在父親的實驗室研究自己的疾病，并在《科學(xué)》雜志報道了研究成果，受到總統(tǒng)接見，19歲時進(jìn)入哈佛大學(xué)讀本科[2]。她的故事還在延續(xù)，在后續(xù)的研究中她研究了嵌合激酶引起的下游基因活化，而其他課題組則構(gòu)建了動物模型，篩選可以治療此病的藥物[3]。Elana的故事很有感染力，她是一名年輕的患者，也是一位科研人員，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計劃(Precision Medicine Initiative)的啟動儀式上，她用自己的經(jīng)歷告訴大家，要從臨床現(xiàn)象出發(fā)，研究現(xiàn)象背后的本質(zhì)，理解年輕的她們或者應(yīng)該說是“我們”，為什么會患這樣稀奇古怪的疾病，有什么樣的辦法可以治愈？在大學(xué)期間，筆者的母親診斷為不明原因肝硬化，遺憾的是她沒有Elana這樣的資源，在過去近二十年的臨床和科研中，筆者先后在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、巴黎Necker兒童醫(yī)院、紐約洛克菲勒大學(xué)和哥倫比亞大學(xué)學(xué)習(xí)與工作，試圖用遺傳的方法，以患者的需求為出發(fā)點，以解決臨床問題作為目的，探索基因與疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系。

本文旨在回顧和展望目前精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)在肝臟疾病中的應(yīng)用進(jìn)展，從纖維板層型肝細(xì)胞肝癌的遺傳學(xué)研究入手，強調(diào)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)在人類遺傳大數(shù)據(jù)的進(jìn)展和戰(zhàn)略性計劃，闡述精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中易患人群、學(xué)術(shù)界和企業(yè)之間的相互關(guān)系，回顧一些具有影響力的遺傳改變引起的肝臟疾病，包括代謝或免疫相關(guān)的肝臟疾病，展望人工智能在肝臟疾病的臨床與遺傳診斷之間的轉(zhuǎn)化作用。

一、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的起源與興起

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)(Precision Medicine)的起源來自于對遺傳認(rèn)知和分析技術(shù)的不斷進(jìn)步[4]，孟德爾的豌豆，達(dá)爾文的鳥嘴，摩爾根的果蠅，從Crick-Waterson的雙螺旋結(jié)構(gòu)到Oswald Avery的轉(zhuǎn)化因子試驗，從定位克隆到人類基因組計劃，從認(rèn)識染色體到基因序列分析，從誘導(dǎo)多能干細(xì)胞到基因編輯，從電子病歷系統(tǒng)到人工智能，涌現(xiàn)出了一系列影響人類未來的技術(shù)性革命。二十一世紀(jì)是生命醫(yī)學(xué)的世紀(jì)，在這個歷史進(jìn)程之中，基礎(chǔ)科學(xué)的進(jìn)步將給臨床實踐帶來質(zhì)的飛越，試想如果沒有核酸檢測技術(shù)，在一線戰(zhàn)斗的我們又如何能鑒別感染性肺炎是由新型冠狀病毒所引起？2005年前后，第二代測序技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于DNA和RNA的序列分析中，與傳統(tǒng)的第一代測序相比，二代測序可以同時對人類所有基因進(jìn)行序列分析，產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)，而對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，可以評估獲得對疾病預(yù)防、診斷和治療具有實際價值的信息。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)有別于隨機(jī)對照雙盲的臨床試驗，是強調(diào)個體化的方案，在軀體上表現(xiàn)出來的一種臨床疾病，盡管一群該病患者看上去很相似，而實際上各有各的區(qū)別。靶向和個體化治療已經(jīng)在腫瘤的臨床診治中廣泛運用。根據(jù)腫瘤遺傳學(xué)特征，如果發(fā)現(xiàn)Bcl-Abl融合基因或C-Kit基因變異，就可以采用靶向藥物格列衛(wèi)治療。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的研究目的是尋找與個體疾病直接相關(guān)的遺傳和環(huán)境因素，廣泛采用各種組學(xué)技術(shù)，而基因組學(xué)技術(shù)是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的核心組成部分。

為了推動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)在臨床中的應(yīng)用，美國各大臨床醫(yī)學(xué)中心紛紛成立直接服務(wù)于臨床的遺傳檢測機(jī)構(gòu)、或隸屬于病理系、或完全獨立的分子遺傳或基因組學(xué)中心，亦有遺傳研究基礎(chǔ)雄厚的臨床科室直接擔(dān)負(fù)重任。美國國立人類基因組研究所設(shè)立了與臨床遺傳相關(guān)的多中心研究項目，如腫瘤遺傳圖譜、臨床基因組資源(ClinGen)、電子病歷和基因組學(xué)網(wǎng)絡(luò)(eMerge)、新生兒測序和公共衛(wèi)生(NSIGHT)、未診斷疾病網(wǎng)絡(luò)(UDN)[5]，同時也有倫理和法律相關(guān)的研究，這些研究項目是人類基因組計劃的延續(xù)，也為臨床遺傳診斷提供了參考藍(lán)圖和信息資源。以ClinGen為例[6]，他們對導(dǎo)致人類單基因疾病的致病基因和相關(guān)變異進(jìn)行了整理和分析，對既往報道有誤的突變進(jìn)行校正。以疾病類型分類，多個臨床遺傳專家根據(jù)現(xiàn)有的遺傳和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，來判斷某個突變是否具有臨床診斷價值，并以美國醫(yī)學(xué)遺傳協(xié)會(ACMG)臨床遺傳診斷指南為依據(jù)發(fā)布報告。UDN以美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)為網(wǎng)絡(luò)核心，提供多中心項目配套支持，為遺傳疾病的診斷、基因功能分析和資源統(tǒng)一及整合提供基礎(chǔ)。2015年啟動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計劃后，All of Us計劃對生活在美國的不同族裔總計一百萬人進(jìn)行健康研究。All of Us計劃收集電子病歷數(shù)據(jù)、健康問卷、體格檢查資料、電子健康資料及對生物學(xué)標(biāo)本的系統(tǒng)分析(包括遺傳分析)[7]。目前大規(guī)模的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)Genome Aggregation Database(Gnomad)、Exome Variant Server(EVS)、HGMD、ClinVar成為臨床遺傳診斷中不可或缺的工具。除政府之外，一些生物制藥公司將目光瞄準(zhǔn)遺傳資源，研究中所發(fā)現(xiàn)的遺傳改變成為治療疾病的靶向，如Regeneron公司與Geisinger醫(yī)院合作對數(shù)十萬美國賓夕法尼亞州居民進(jìn)行遺傳體檢，發(fā)現(xiàn)了脂肪肝和肝硬化相關(guān)的保護(hù)基因，而公司與醫(yī)療系統(tǒng)遺傳合作的這一趨勢目前仍在擴(kuò)大。在歐洲，Orphanet為罕見病患者和孤兒藥提供信息服務(wù)，英國的生物樣本庫(UK Biobank)有近50萬志愿者的遺傳和長期隨訪臨床數(shù)據(jù)，科研人員可以申請開放研究計劃。如果沒有這些遺傳基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)，單純討論一種疾病的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用則是水中月，夢中花。

二、代謝相關(guān)疾病的肝臟表現(xiàn)

在歐美國家，脂肪肝儼然已成為肝臟的“頭號殺手”脂肪肝導(dǎo)致的終末期肝臟病已經(jīng)成為接受肝移植的首要原因。脂肪肝在臨床上表現(xiàn)多樣，有肥胖直接相關(guān)的脂肪肝，也有體重正常的脂肪肝。根據(jù)病理表現(xiàn)是否有炎癥將非酒精性脂肪肝分為非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

代謝研究的輝煌時期是五十年前，通過生物化學(xué)的方法來研究各種代謝所需的底物、關(guān)鍵酶和下游產(chǎn)物。Banting發(fā)現(xiàn)了胰島素，李卓浩發(fā)現(xiàn)了促腎上腺皮質(zhì)激素。一只被稱為ob/ob的肥胖小鼠引起Jeffrey Friedman關(guān)注，歷時8年，在遺傳標(biāo)志位點稀缺的時代，成功克隆了瘦素基因(Leptin)[8]。臨床上目前有瘦素、瘦素受體、MC4R、SIM1等單基因缺陷引起的能量平衡障礙，并導(dǎo)致肥胖和脂肪肝的發(fā)生。Hobbs等[9]在達(dá)拉斯心臟研究隊列中通過關(guān)注臨床表現(xiàn)極端罕見的患者，發(fā)現(xiàn)PCSK9基因及其在膽固醇調(diào)節(jié)中具有重要作用，而針對PCSK9的單抗藥物目前已用于臨床高脂血癥患者，尤其是對他汀類藥物治療無效的患者。Helen Hobbs的團(tuán)隊在脂肪肝遺傳因素的研究中還發(fā)現(xiàn)了PNPL3基因與脂肪肝的相關(guān)性，其團(tuán)隊和Regeneron同時報道了HSD17B13基因在脂肪肝和其他慢性肝病中的保護(hù)作用，而目前眾多的制藥企業(yè)已將HSD17B13作為治療脂肪肝的靶向開發(fā)藥物[10-11]。

脂肪在肝臟中的異常堆積還可以出現(xiàn)在一些罕見的肝臟疾病中。急性妊娠脂肪肝(AFLP)是一種起病急、同時危及母嬰安全的疾病。2005年一名27歲的女性妊娠患者出現(xiàn)急性肝衰竭，伴膽酶分離、凝血功能異常、肝性腦病、腦水腫、低血糖、急性腎功能衰竭，在行緊急剖腹產(chǎn)術(shù)后，病情依然惡化，李宏為教授的肝移植團(tuán)隊對該患者行肝移植術(shù)，一個月后母嬰轉(zhuǎn)危為安[12]。切除的肝臟病理檢查結(jié)果提示肝細(xì)胞廣泛微小囊泡狀脂肪滴沉積，查閱文獻(xiàn)提示線粒體脂肪酸代謝通路的異?？梢鸫瞬。谑窃趶埿佬澜淌诘闹笇?dǎo)下，我們對患者及其家屬進(jìn)行脂肪酸代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜分析，并對長鏈脂肪酸脫氫酶基因(LCHAD)進(jìn)行測序，但并未發(fā)現(xiàn)基因缺陷。雖然是一個陰性的遺傳結(jié)果，但這名患者卻指引我們繼續(xù)考慮遺傳學(xué)在臨床肝病上的應(yīng)用。此后，我們陸續(xù)收集到一些肝功能檢查結(jié)果反復(fù)異常、臨床病理診斷為脂肪肝的患者。一個家庭中兩名十幾歲的男孩轉(zhuǎn)氨酶始終在200 IU/ml左右，保肝降酶處理并不能解決實際問題，這兩名患者還偶爾有低血糖并伴肌酶異常，且在脂肪酸質(zhì)譜檢查時發(fā)現(xiàn)存在中鏈脂肪酸水平明顯升高。李新華博士排除了其中鏈脂肪酸脫氫酶缺陷(MCAD)和Ⅰ型糖原累積癥的可能，在對患者臨床代謝信息進(jìn)一步整理和擴(kuò)大疑似基因范圍后，發(fā)現(xiàn)這兩個患者都是Ⅲ型糖原累積癥[13]。遺傳學(xué)上的確診為臨床治療提供了直接指導(dǎo)依據(jù)，這一結(jié)果與國際上報道的糖原累積癥引起的脂肪肝不謀而合。

肝臟作為重要的代謝器官，臨床醫(yī)生一方面要意識到廣泛鑒別診斷的重要性，同時也需要一個可以協(xié)作的會診中心。在過去的臨床實踐和遺傳研究中，先后對患有紅細(xì)胞生成型原卟啉病[14]、急性間隙性卟啉病[15]、Wilson’s病、血色素病、溶酶體病、先天性糖基化障礙、原發(fā)性高草酸尿癥、囊性纖維化、抗胰蛋白酶缺陷的肝臟病患者進(jìn)行了遺傳診斷和隨訪治療，這些遺傳疾病的診斷與對應(yīng)靶向孤兒藥物應(yīng)用已經(jīng)越來越受到重視。

三、遺傳缺陷和肝臟感染與炎癥

目前，病毒性肝炎仍是危害人類健康的重要疾病，對病毒性肝炎宿主遺傳易感性的研究由來已久，是否存在單基因缺陷從而導(dǎo)致病毒性肝炎感染相關(guān)的嚴(yán)重臨床表現(xiàn)目前仍在探索之中，而全基因關(guān)聯(lián)分析(GWAS)結(jié)果對臨床的指導(dǎo)價值有限。在這個領(lǐng)域可以關(guān)注周剛橋、賀福初、Andrian V.S Hill、David Goldstein等在遺傳易感性[16]、干擾素治療應(yīng)答方面的研究。我們曾嘗試過在乙型肝炎病毒(HBV)感染中采用病例對照設(shè)計研究干擾素相關(guān)基因單核苷酸基因多態(tài)性與臨床表型的相關(guān)性，主要問題是明顯的統(tǒng)計學(xué)差異下微弱的相對危險度。近年來李文輝團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)HBV受體SLC10A1(NTCP)其中基因的一個S267F單核苷酸多態(tài)性(SNP)在體外的細(xì)胞學(xué)研究中存在功能障礙，部分報道稱該SNP與HBV患者的臨床預(yù)后具有相關(guān)性[17]，但未能在大規(guī)模的GWAS數(shù)據(jù)中證實[18]。在丙型肝炎病毒(HCV)感染領(lǐng)域，隨著Sofia等[19]對原藥進(jìn)行開創(chuàng)性的側(cè)鏈改造，研發(fā)可以治愈HCV的關(guān)鍵藥物索非布韋，目前用于支持丙型病毒性肝炎的研究基金急劇萎縮，而在臨床一線甚至已將HCV感染者作為肝移植的供體。

病毒感染導(dǎo)致暴發(fā)型肝炎是一種臨床罕見的急性肝衰竭，患者既往無肝臟疾病史，起病2周內(nèi)出現(xiàn)以凝血障礙和肝性腦病為主的癥候群，病理結(jié)果表現(xiàn)為大片肝組織壞死。我的博士導(dǎo)師Jean-Laurent Casanova一直致力于兒童重癥感染與單基因缺陷的研究。最近在一例近親結(jié)婚的家系里，先證者在感染甲型肝炎病毒后發(fā)生肝衰竭，通過家系全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)先證者存在常染色體隱性(AR)白細(xì)胞介素(IL)-18BP缺陷，IL-18BP能夠抑制炎癥反應(yīng)的過度激活，而IL-18BP的缺陷導(dǎo)致免疫系統(tǒng)攻擊肝細(xì)胞，類似與炎癥風(fēng)暴中看到的肝臟損傷[20]。在單基因缺陷導(dǎo)致的免疫缺陷性疾病中，一系列患者出現(xiàn)肝臟問題，STAT-1基因能夠調(diào)節(jié)三種不同亞型干擾素的應(yīng)答，播散性皰疹病毒感染[EB病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、人皰疹病毒(HHV)-6]引起重癥肝損傷在AR STAT-1完全缺陷患者中已有報道。Ⅰ型干擾素受體IFNAR1和IFNAR2完全缺陷患者可以出現(xiàn)接種活疫苗之后的嚴(yán)重感染，包括由麻腮風(fēng)三聯(lián)疫苗(MMR)、黃熱病毒疫苗引起的肝臟損害，均可能出現(xiàn)繼發(fā)性噬血細(xì)胞淋巴細(xì)胞增生癥(HLH)[21-22]。在單基因缺陷導(dǎo)致的自身免疫性淋巴細(xì)胞增生性增殖癥(ALPS)中，患者存在淋巴細(xì)胞凋亡障礙，90%患者有脾腫大，40%～50%的患者出現(xiàn)肝腫大，F(xiàn)ADD基因缺陷的患者出現(xiàn)嚴(yán)重肝臟病變[23]。肝內(nèi)金黃色葡萄球菌感染引起的膿腫在慢性肉芽腫病患者中時有報道[24]，而肺炎克雷伯氏菌感染導(dǎo)致的肝臟膿腫其遺傳因素尚在研究中。肝內(nèi)侵襲性真菌感染在功能獲得型(Gain-of-function)STAT1和AR CARD9缺陷患者中被報道[25]。此外，隱孢子蟲引起的膽道感染、膽管炎和肝硬化是IL-21受體(AR IL-21R)完全缺陷的重要臨床表現(xiàn)[26]。

部分原發(fā)性免疫缺陷的患者臨床可以出現(xiàn)自身免疫性肝炎的表現(xiàn)，如AIRE基因缺陷導(dǎo)致的自身免疫多內(nèi)分泌腺病綜合征(APECED)。普通異變型免疫缺陷(CVID)又稱遲發(fā)性低丙種球蛋白血癥，其臨床表現(xiàn)譜極廣泛，患者有反復(fù)慢性感染，IgG水平低下，對疫苗應(yīng)答差。CVID既可能是單基因引起的免疫缺陷，也可以是多基因參與致病，致病基因涵蓋ICOS、TACI、BAFF-R、PIK3CD等，這一系列基因在B淋巴細(xì)胞發(fā)育、增殖和分化中具有重要功能。自身免疫病、淋巴細(xì)胞增殖性疾病和腫瘤在CVID患者中并不罕見。在部分CVID患者中可以同時出現(xiàn)免疫性腸病(如乳糜瀉[Celiac Disease)]和肝臟疾病，后者可以表現(xiàn)為堿性磷酸酶升高、NRH、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)/原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)，甚至發(fā)展為肝硬化和肝癌[27]。

四、肝臟疾病遺傳診斷的人工智能開發(fā)

在基因和臨床表型因果關(guān)系中，目前OMIM數(shù)據(jù)庫已知引起肝臟異常的單基因疾病共涉及400余基因，在筆者過去的臨床遺傳診斷中，有JAG1基因變異導(dǎo)致的Alagille綜合征，或NOTCH相關(guān)基因變異引起的膽道閉鎖，凝血因子V基因缺陷導(dǎo)致的肝內(nèi)血栓，HNF1A變異引起的肝細(xì)胞腺瘤，TALDO1基因(轉(zhuǎn)醛醇酶)變異引起的肝病，顯性和隱性多囊腎多囊肝，膽汁代謝障礙和進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥。隨著二代測序的普及，單基因缺陷導(dǎo)致的肝臟疾病仍在不斷的增長，如膽道閉鎖患者與PKD1L1[28]、非特異性門脈高壓癥患者與DGUOK[29]、反復(fù)肝衰竭與NBAS和RINT1[30-31]等。

如何利用臨床數(shù)據(jù)和下一代基因測序分析對疑難肝臟疾病進(jìn)行快速準(zhǔn)確的診斷是很多科研人員關(guān)心的問題。一套人工智能診斷系統(tǒng)勢在必行，部分研究已經(jīng)開始將人工智能應(yīng)用于臨床，如把OMIM單基因疾病所涉及的臨床問題換成ICD-10，一個基因?qū)?yīng)數(shù)個相關(guān)的ICD-10；而在遺傳方面，把400余個肝臟相關(guān)基因的致病變異進(jìn)行標(biāo)記。這樣一方面能在患者電子病歷中調(diào)用ICD-10 code，尋找OMIM中可能的疾病，另一方面從測序的結(jié)果中篩查可能致病的突變，再返回OMIM之中尋找最佳的臨床表型-基因型的配對，以此對患者進(jìn)行快速的遺傳診斷[32]。

綜上所述，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，我們通過遺傳研究不斷更新知識，認(rèn)清疾病的本質(zhì)，也為未來醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展提供方向。