周維成，卞杰松，劉 晶，蔡明基，楊鈞惠，李曉平，楊德俊

（1. 湘南學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 郴州 423000；2. 湖南省嘉禾縣三味 食品有限公司，湖南 郴州 423000）

剁辣椒是湖南的特色食品，酸辣可口，深受消費(fèi)者喜愛。剁辣椒主要利用天然乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，一方面發(fā)酵速度慢，另一方面品質(zhì)的形成受自然條件的影響非常大，常因?yàn)樽匀粭l件的變化而導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)發(fā)生變化[1]。因此，篩選高效、耐鹽、耐酸同時(shí)具有較強(qiáng)亞硝酸鹽降解能力的優(yōu)良乳酸菌進(jìn)行純種發(fā)酵，成為提高剁辣椒發(fā)酵品質(zhì)的重要途徑。目前從剁辣椒中分離出的發(fā)酵菌主要是植物乳桿菌、短乳桿菌、戊糖片球菌等，但以乳桿菌為主。葉陵等[2]從12 份剁辣椒樣品中分離出乳酸菌，用產(chǎn)酸、亞硝酸鹽降解率等指標(biāo)篩選出優(yōu)良的乳酸菌，并對其進(jìn)行鑒定，然后進(jìn)行耐鹽、耐酸能力的比較。隨后，葉陵等[3]以篩選到的優(yōu)良植物乳桿菌W-4 作為發(fā)酵菌株進(jìn)行純種發(fā)酵，觀察發(fā)酵過程中剁辣椒中微生物菌群及有機(jī)酸的變化規(guī)律，進(jìn)一步闡明植物乳桿菌在剁辣椒發(fā)酵過程中的作用機(jī)制。胡博涵等[4]采用乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵的方式生產(chǎn)剁辣椒，研究其適宜發(fā)酵條件，為縮短發(fā)酵周期，提高剁辣椒品質(zhì)做出了相關(guān)貢獻(xiàn)。郭蓉等[5]也從剁辣椒中分離出一株乳酸菌，在接種發(fā)酵過程中相比其他乳酸菌亞硝酸鹽含量低。徐浩等[6]篩選出一株耐鹽在24%以上的酵母菌，經(jīng)鑒定為魯氏結(jié)合酵母。

目前，以人工接種方式進(jìn)行剁辣椒工業(yè)化生產(chǎn)尚處于起步階段。為了使傳統(tǒng)產(chǎn)品在工業(yè)化過程中仍能保持其特色，筆者擬從剁辣椒中篩選出優(yōu)良乳酸菌菌株，通過研究其生長繁殖與代謝特性，優(yōu)化其培養(yǎng)條件，為剁辣椒工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

剁辣椒來源于湖南省郴州市嘉禾縣三味食品有限公司；MRS 培養(yǎng)基購自北京索萊寶，其他試劑均為分析純（均購于國藥化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50FBS，上海申安醫(yī)療器械廠）；pH 值計(jì)（E-301F pH 三復(fù)合電極，雷磁）；紫外可見分光光度計(jì)（UVmini-1240，島津）；電子恒溫水浴鍋（HH-2，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)品有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101 型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；離心機(jī)（TDZ5-WS，湘儀）；PCR 擴(kuò)增儀（MiniAmp Plus，賽默飛世爾）；電泳儀（DYCP-31BN，北京六一生物科技有限公司）；紫外凝膠成像儀（BOT-III，中儀博騰）

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 剁辣椒中乳酸菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察 無菌條件下，取10 g 剁辣椒溶于100 mL 無菌生理鹽水中，搖勻，經(jīng)系列稀釋后涂布MRS 固體平板中，37℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落至新的MRS平板上進(jìn)行劃線純化，將純化的單菌落進(jìn)行保存。對分離菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。

1.3.2 分子鑒定 取適量菌液，CTAB 法提取DNA。利用16s rRNA 通用引物5F：ATGAACGCTGGCGGTA TG，819R：TTCCTTTGAGTTTCACAGTTGC 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：12.5 μL Taq MasterMix（康為世紀(jì)），10 μmol/L 上下游引物各1 μL，1 μL 總DNA，補(bǔ)無菌水至25 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物切膠回收，連接pMD18-T 載體（Takara，Japan），測序。在NCBI 中進(jìn)行BLAST 序列比對分析。利用Mega 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 生長曲線的測定 將活化菌株按2%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，每4 h 于紫外分光度計(jì)下測定600 nm 處培養(yǎng)基吸光值。

1.3.4 耐酸性試驗(yàn) 將活化的乳桿菌分別接種于pH值為3、5 和7 的MRS 培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24 h，每隔4 h 測定600 nm 處吸光值。

1.3.5 亞硝酸鹽降解率測定 取2 mL 活化菌液，接種 至100 mL 含有100 mg/L NaNO2的MRS 培養(yǎng)基中， 37℃搖床培養(yǎng)24 h后，離心取上清按照GB/T 5009.33— 2003 測定培養(yǎng)基中NaNO2濃度。

1.3.6 耐鹽性試驗(yàn) 配制不同鹽濃度（0、5%、7%、10%、12%和15%）的MRS 培養(yǎng)基，分別接種等量2%的活化菌液，37℃搖床培養(yǎng)24 h，測定600 nm 處吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌的分離與鑒定

挑取單菌落進(jìn)行多次劃線后，菌落形態(tài)呈圓形，表面光滑，白色。對純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陽性菌株（圖1 a），菌體呈桿狀。16s rRNA 序列比對后發(fā)現(xiàn)該菌株與植物乳桿菌（L. plantarum）最為相近（圖1 b），NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST比對顯示與L. plantarum 的相似性可達(dá)99.9%，因此將分離獲得的菌株命名為L. plantarum SW。

2.2 菌株生長特性

圖1 分離菌株形態(tài)與系統(tǒng)發(fā)育樹

SW 菌株在MRS 液體培養(yǎng)基中的生長曲線見圖2，接種0～8 h 內(nèi)，菌株生長較緩慢，隨后菌體生長速率快速增加，24 h 后菌株數(shù)量相對緩慢，培養(yǎng)32 h 時(shí)菌株數(shù)量達(dá)最大值，隨后，菌株數(shù)量開始下降。

2.3 不同pH 值對菌株生長的影響

不同pH 值條件下SW 菌株生長狀況見圖3，當(dāng)在pH 值為3 時(shí)，SW 菌株數(shù)量在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)無顯著變化，當(dāng)pH 值為5 和7 時(shí)，隨著pH 值的增加菌株增長速率加快。24 h 時(shí)，pH 值為7 時(shí)處理組菌 株生長速率相對pH 值為3 和5 時(shí)增加了57%和31%。

圖2 SW 菌株的生長曲線

圖3 不同pH 值條件下菌株生長狀況

2.4 菌株對亞硝酸鹽降解能力分析

隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，SW 菌株對亞硝酸鹽的降解能力不斷增強(qiáng)（圖4），培養(yǎng)24 h 后含有SW 菌株的MRS 培養(yǎng)基中亞硝酸鈉含量下降至空白對照的21%，表明菌株SW 具有較強(qiáng)的亞硝酸鹽降解能力。

圖4 菌株對亞硝酸鹽降解能力

2.5 氯化鈉對菌株生長的影響

由圖5 可知，在不含氯化鈉培養(yǎng)基中SW 菌株生長狀況最好，隨著鹽濃度的升高，SW 菌株的生長速率逐漸減慢，當(dāng)氯化鈉濃度為15%時(shí)，SW 菌株的吸光值僅為0.57，同對照相比生長速率降低了53%。表明氯化鈉會(huì)抑制菌株SW 的生長。

圖5 不同氯化鈉濃度菌株生長狀況

3 結(jié)論和討論

傳統(tǒng)的菌種分離鑒定手段很難通過單一方式對菌株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)為研究微生物種類和組成提供一條準(zhǔn)確、高效的技術(shù)手段。形態(tài)學(xué)特征結(jié)合rDNA 測序的分析鑒定方法已成為菌種分離鑒定的主要方式。卿煜維等[7]利用16s rDNA 序列鑒定了4 株亞硝酸鹽降解乳酸菌。徐浩等[6]采用26s rDNA 測序法將分離的耐鹽酵母菌鑒定為魯氏接合酵母。潘睛等[8]在泡菜中基于通過16s rDNA 基因序列比較準(zhǔn)確鑒定了從泡菜中分離的12 株乳酸菌。筆者在研究了SW 菌株形態(tài)特征的基礎(chǔ)上，對其16s rDNA 基因進(jìn)行測序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終確定該菌株為植物乳桿菌。

剁辣椒發(fā)酵過程中，乳酸菌不僅可以降低發(fā)酵液pH 值，改善辣椒原始組織構(gòu)造，同時(shí)還可促進(jìn)其風(fēng)味與色澤的形成。發(fā)酵液中的離子強(qiáng)度會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而變化，為了抑制雜菌的生長，發(fā)酵液往往含有大量鹽分，因此剁辣椒發(fā)酵過程中乳酸菌具有一定的耐鹽性。李梓銘等[9]在鹽坯辣椒中分離出一株可以在氯化鈉含量為18%的培養(yǎng)基生長的植物乳酸桿菌。這是因?yàn)橹参锶闂U菌與其他乳酸菌相比具有較多的植物多酚降解基因，具有更強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境脅迫的能力。葉陵等[2]比較植物乳桿菌與短乳桿菌后發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌具有較強(qiáng)的耐酸和耐鹽能力。筆者從剁辣椒中分離的SW 菌株在鹽脅迫條件下生長速率減慢，但在高鹽環(huán)境中仍可以生長，說明該植物乳桿菌具有一定的耐鹽能力。食品中硝酸鹽或亞硝酸鹽的含量過高，會(huì)造成高鐵血紅蛋白癥，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)人體窒息死 亡[10]。乳酸菌對亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的降解能力，這主要?dú)w功于乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生乳酸和一系列酶，同時(shí)乳酸菌還具有抑制亞硝酸鹽還原酶生長的功能。研究對分離的植物乳桿菌SW 進(jìn)行亞硝酸降解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株具有較強(qiáng)的亞硝酸鹽降解能力。