廣東省東莞市婦幼保健院（523000）羅建華 徐婉芳 袁海明

CAKUT是臨床一種常見的多樣性先天缺陷疾病，其發(fā)生與胚胎期腎臟發(fā)育缺陷存在相關(guān)性。CAKUT在活產(chǎn)兒中較為罕見，但在先天性結(jié)構(gòu)畸形中發(fā)生率較高，約為20%～30%，部分患兒可合并其他系統(tǒng)異常病變，對(duì)新生兒、胎兒存活與預(yù)后造成嚴(yán)重影響。早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)、診斷CAKUT發(fā)生，對(duì)改善新生兒結(jié)局等意義重大[1]。WES是一種新型現(xiàn)代基因診斷技術(shù)，通過對(duì)疾病相關(guān)基因進(jìn)行診斷，判斷其致病性[2]。本研究，通過對(duì)2019年1月～2020年3月我院收治的100例超聲提示CAKUT病例應(yīng)用WES技術(shù)檢查，分析其對(duì)致病性檢出率，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入我院2019年1月～2020年3月收治的超前超聲提示100例CAKUT病例，所有胎兒經(jīng)染色體微陣列分析（CMA）未見異常；根據(jù)是否合并其他系統(tǒng)異常分組，A組74例單純CAKUT病例，孕婦年齡18～32歲，平均年齡（24.5±6.2）歲；B組26例CAKUT合并其他系統(tǒng)異常，孕婦年齡19～30歲，平均年齡（25.1±6.5）歲。兩組資料比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：納入對(duì)象無(wú)腎臟異常家族史，夫妻非近親結(jié)婚，所有家屬對(duì)研究知情，同意參與。

1.2 方法 外顯子組測(cè)序：將50μL TE與1μg樣本DNA混合，將DNA采用Bioruptor超聲破碎儀片段化至200～250bp；末端補(bǔ)平、3'端腺苷化、接頭連接、片段選擇、擴(kuò)增過程等依次采用Illumina FC-121-2033 DNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒進(jìn)行構(gòu)建DNA文庫(kù)。目標(biāo)區(qū)域捕獲采用Hybridization Wash Kit試劑盒、NimbleGen捕獲磁珠進(jìn)行，再對(duì)目標(biāo)區(qū)域采用瑞士羅氏公司高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增（濃度≥10nmol/L），PE100測(cè)序采用Hiseq 2500高通量模式進(jìn)行。

1.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 對(duì)可能致病性、含有致病性突變位點(diǎn)的胎兒、父母采用Sanger測(cè)序方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 數(shù)據(jù)處理 突變剪切危害性預(yù)測(cè)與蛋白功能影響、注釋功能的預(yù)測(cè)根據(jù)ACMG指南進(jìn)行，最后將判定所有突變位點(diǎn)，可分為以下幾類：良性、可能良性、不明確、可能致病性、致病性。

2 結(jié)果

2.1 分析WES檢測(cè)結(jié)果 本研究對(duì)100例超聲提示CAKUT病例進(jìn)行WES檢測(cè)，結(jié)果顯示，檢測(cè)出致病性突變病例15例，涉及基因?yàn)锽BS2、HNF1B、NEK8、UMOD；可能致病性突變7例，涉及基因GRIN2B、HSPD1。在CAKUT病例中，WES的陽(yáng)性檢出率為22.00%（22/100）；本組22例陽(yáng)性樣本中，CAKUT合并其他系統(tǒng)異常檢出率為57.69%（15/26），單純CAKUT病例中陽(yáng)性檢出率為9.46%（7/74）。

2.2 分析兩組WES檢測(cè)結(jié)果 研究顯示，在A組74例CAKUT病例中，WES檢測(cè)陽(yáng)性率為20.27%（15/74），其中3例病例顯性遺傳基因中存1個(gè)可能致病性突變，另7例含有致病性突變；WES周轉(zhuǎn)時(shí)間11～12周，WES分析顯示，26例胎兒結(jié)果可在孕周35+4～39+2周完成。

B組26例病例中，核心家系WES檢測(cè)陽(yáng)性率為26.92%（7/26），其中存在可能致病性突變3例，存在致病性突變2例，未檢測(cè)出有臨床意義突變13例；WES周轉(zhuǎn)時(shí)間8～9周，本組2例得到致病性結(jié)果夫婦均選擇終止妊娠。

B組實(shí)施核心家系檢查，WES陽(yáng)性率高于A組，提示核心家系檢查可提高胎兒陽(yáng)性率，但兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

目前，臨床關(guān)于CAKUT致病基因方面的報(bào)道較少，有研究指出，CAKUT形成可因單個(gè)基因缺陷引起病變。臨床中，最早發(fā)現(xiàn)CAKUT的致病基因是HNF1B、PAX2兩個(gè)基因。近年來(lái)，隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，基因檢測(cè)不斷有新發(fā)現(xiàn)。臨床產(chǎn)前檢查中若超聲提示CAKUT的胎兒，需要進(jìn)一步檢查，詢問夫婦是否存在孕產(chǎn)史及家族史，判斷胎兒是否出現(xiàn)染色體異常。本研究顯示，對(duì)100例超聲提示CAKUT病例進(jìn)行WES檢測(cè)，結(jié)果顯示，在CAKUT病例中，WES的陽(yáng)性檢出率為22.00%，提示單基因變異在CAKUT發(fā)生中起到重要作用，其致病性突變基因包括：BBS2、HNF1B、NEK8、UMOD，作為已知致病基因與腎臟發(fā)育存在明顯關(guān)系。GRIN2B、HSPD1基因與MRD6/EIEE27與SPG13基因相關(guān)，包含可能致病性突變。本研究顯示，22例陽(yáng)性檢出患者中，單純CAKUT病例中陽(yáng)性檢出率為9.46%（7/74），合并其他系統(tǒng)異常檢出為57.69%（15/26），說(shuō)明相比于單純CAKUT，合并其他系統(tǒng)異常更容易發(fā)生基因突變。對(duì)此，本研究受到研究樣本數(shù)限制，可能存在一定誤差，需要大樣本進(jìn)一步作為研究支持。

本研究產(chǎn)前超聲提示回聲增強(qiáng)、雙側(cè)腎臟增大2例胎兒中，檢測(cè)出基因雜合突變，突變基因?yàn)镠NF1B基因c.192-191 insGTAT突變，另3例產(chǎn)前超聲提示左側(cè)腦室增寬雙側(cè)腎臟回聲增強(qiáng)、腎臟增大的胎兒病例中，經(jīng)過WES檢查顯示，基因型中存在BBS2基因復(fù)合雜合突變，突變基因?yàn)锽BS2的c.1015G＞A與c.823G＞A突變。本研究顯示，這5例基因突變患兒與RCDS/腎臟回聲增強(qiáng)、BBS2存在相關(guān)性。但由于本研究納入對(duì)象較少，研究結(jié)果存在一定誤差，無(wú)法確定孤立性腎臟回聲增強(qiáng)但GMA與核型結(jié)果正常的胎兒是否需要接受WES進(jìn)一步進(jìn)行診斷，因?yàn)榧幢闾寒a(chǎn)前超聲顯示腎臟回聲增強(qiáng)，但并不能作為判定胎兒產(chǎn)后腎臟發(fā)育異常的特異性指標(biāo)，仍有部分患兒產(chǎn)后并未出現(xiàn)異常情況[3]。對(duì)此，臨床同樣需要高度重視，產(chǎn)前胎兒腎臟回聲異常也是提示腎臟綜合性疾病、明顯畸形病變的重要指標(biāo)，因此。臨床在超聲診斷時(shí)需輔助其他手段進(jìn)一步確診[4]。

WES作為一種診斷測(cè)序的重要手段，測(cè)序的孕周選擇尤為重要。本研究對(duì)A組孕婦WES周轉(zhuǎn)時(shí)間11～12周，WES分析顯示，26例胎兒結(jié)果可在孕周35+4～39+2周完成；B組26例病例中，WES周轉(zhuǎn)時(shí)間8～9周，本組2例得到致病性結(jié)果的夫婦均選擇終止妊娠。目前，臨床中對(duì)于WES周轉(zhuǎn)時(shí)間一般為8～15周；據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，大部分孕婦希望周轉(zhuǎn)時(shí)間＜3周[5]。因此，在產(chǎn)前診斷中，WES需要加快分析與檢測(cè)速度，以提高其優(yōu)越性。在對(duì)孕婦胎兒進(jìn)行WES測(cè)序時(shí)，對(duì)胎兒父母外周血樣本進(jìn)行收集、檢驗(yàn)，有利于提高WES致病性檢出率準(zhǔn)確性。本研究顯示，A組WES檢測(cè)陽(yáng)性率為20.27%，B組核心家系WES檢測(cè)陽(yáng)性率為26.92%，說(shuō)明對(duì)胎兒核心家系進(jìn)行分析，能夠提高胎兒的陽(yáng)性檢出率。

綜上所述，產(chǎn)前超聲提示CAKUT胎兒通過WES測(cè)序診斷，能有效提高致病性檢出率。