黃奕雯

(福建省漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)中心，福建 福州 350003)

赤潮是由于受環(huán)境氣候影響，水域中的浮游植物、原生生物、細(xì)菌等暴發(fā)性增殖或聚集而引起水體變異樣的一種有害生態(tài)異?，F(xiàn)象[1]。其不僅會(huì)使魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)等因呼吸困難而死亡，同時(shí)有毒赤潮藻的毒素會(huì)在貝類(lèi)等海洋生物體內(nèi)積累并向食物鏈上層傳遞[2]，從而對(duì)人類(lèi)生命健康產(chǎn)生危害。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，我國(guó)近岸海域水體富營(yíng)養(yǎng)化程度日趨嚴(yán)重，加上特殊的海灣環(huán)境和氣候條件，近年來(lái)有毒有害赤潮不斷發(fā)生，嚴(yán)重威脅到漁業(yè)生產(chǎn)安全和民眾身體健康。

麻痹性貝毒(Paralytic shellfish poisoning，PSP)是迄今為止世界范圍內(nèi)分布最廣、危害最大的一類(lèi)赤潮生物毒素，已成為當(dāng)前海洋科學(xué)的研究熱點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。麻痹性貝毒與河豚毒素作用機(jī)理類(lèi)似，是一種鈉離子(Na+)通道阻滯劑[3]，主要通過(guò)阻斷Na+內(nèi)流來(lái)抑制細(xì)胞動(dòng)作電位的傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙而產(chǎn)生麻痹作用。中毒表現(xiàn)為食用后0.5 h至3.0 h內(nèi)引起嘴、唇、舌麻木或有刺痛感，產(chǎn)生頭痛、暈眩、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重者肌肉麻痹、四肢抽搐、呼吸困難，甚至窒息而亡[4-5]。麻痹性貝毒是一類(lèi)四氫嘌呤的三環(huán)化合物[6]，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，是由石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)及其天然衍生物組成的胍類(lèi)毒素，易溶于水，在酸性條件下耐熱[7]。目前已發(fā)現(xiàn)的麻痹性貝類(lèi)毒素有二十幾種，根據(jù)R4取代基團(tuán)的差異，可以將其分為四類(lèi)：氨基甲酸酯類(lèi)毒素(Carbamate toxins)的R4基團(tuán)為“-COONH2”，包括石房蛤毒素、新石房蛤毒素、膝溝藻毒素1～4等；N-磺酰氨甲酰基類(lèi)毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)的R4基團(tuán)為“-COONHSO3”，包括膝溝藻毒素5～6等；脫氨甲?；?lèi)毒素(Decarbamoyl toxins)的R4基團(tuán)為“-OH”，包括脫氨甲?；扛蚨舅?、脫氨甲?；率扛蚨舅氐?；脫氧脫氨甲酰基類(lèi)毒素(Deoxydecarbamoyl toxins)的R4基團(tuán)為“-H”，包括脫氧脫氨甲?；扛蚨舅?、脫氧脫氨甲?；显宥舅?～3等[8-9]。其中石房蛤毒素占麻痹性貝毒的85%以上，是主要毒素[10]。我國(guó)及國(guó)際上多數(shù)國(guó)家都以石房蛤毒素為貝類(lèi)產(chǎn)品中麻痹性貝毒的檢測(cè)指標(biāo)，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)均規(guī)定貝類(lèi)中PSP的限量標(biāo)準(zhǔn)為80 μg STX/100 g[11-12]，即以800 μg/kg STX含量為限量標(biāo)準(zhǔn)。

目前，我國(guó)麻痹性貝毒的檢測(cè)方法主要有小鼠生物法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、液相色譜法(LC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[13]。這些常規(guī)檢測(cè)方法主要依托實(shí)驗(yàn)室建立，對(duì)儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)耗材、環(huán)境條件和操作技能等都有較高的要求，需由專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員開(kāi)展相關(guān)檢測(cè)，并且大多檢測(cè)周期較長(zhǎng)、價(jià)格昂貴，當(dāng)樣品量大或遇到赤潮應(yīng)急監(jiān)測(cè)時(shí)，其檢測(cè)效率則難以滿(mǎn)足實(shí)際工作的需求。因此，建立簡(jiǎn)便實(shí)用、快速有效、容易推廣的貝類(lèi)毒素檢測(cè)方法顯得尤為重要。膠體金快速檢測(cè)技術(shù)是20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的新興免疫層析檢測(cè)技術(shù)，其利用抗原-抗體特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)和層析反應(yīng)原理，以干片法試紙的形式，將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，用膠體金標(biāo)記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，應(yīng)用微孔膜的毛細(xì)血管作用，通過(guò)抗原-抗體結(jié)合及膠體金顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)。該方法具有操作便捷、成本低廉、結(jié)果判斷簡(jiǎn)單、適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。本研究對(duì)一種石房蛤毒素膠體金快速檢測(cè)試紙卡進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用測(cè)試，旨在為提高貝毒檢測(cè)效率、赤潮期間貝類(lèi)質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)防控能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試牡蠣、縊蟶、花蛤等貝類(lèi)樣品采集于福建沿海地區(qū)，儲(chǔ)存于-20℃低溫冰箱待測(cè)。石房蛤毒素(STX)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自臺(tái)灣藻研有限公司(Taiwan Algal Science Inc)，1 mg/瓶。石房蛤毒素膠體金快速檢測(cè)試紙卡由福建省水產(chǎn)研究所研制，配有提取緩沖液濃縮片劑、50 mL離心管和一次性塑料滴管。

1.2 儀器與設(shè)備

均質(zhì)器；電子天平(精度0.1 g)；小型電磁爐；計(jì)時(shí)器。

1.3 樣品處理與制備

將貝類(lèi)樣品的外殼用清水徹底洗凈，切斷閉殼肌，開(kāi)殼，用蒸餾水淋洗內(nèi)部去除泥沙等雜質(zhì)，小心取出貝肉，切勿割破貝體，不得以加熱或藥物方式開(kāi)殼。收集約200 g去殼貝肉瀝水5 min(應(yīng)避免貝肉堆積)，撿出碎殼等雜物，將貝肉均質(zhì)備用。

1.4 膠體金快速檢測(cè)方法

1.4.1 檢測(cè)步驟

取緩沖液片劑5片，用純水配制成500 mL的溶液(可用礦泉水瓶配制)。稱(chēng)取5 g均質(zhì)后的貝類(lèi)樣品于50 mL離心管中，加入20 mL上述溶液，稍加振蕩后沸水浴提取10 min，冷卻至室溫，待檢。如未立即檢測(cè)，可將提取液冷藏保存，長(zhǎng)期保存應(yīng)于-20℃冷凍提取液。使用前應(yīng)將待檢提取液恢復(fù)至室溫。

從原包裝鋁箔袋中取出膠體金快檢試紙卡和一次性滴管，置于水平清潔的桌面上。用一次性滴管吸取待檢樣本，垂直滴加4滴于加樣孔中，加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)，3～5 min內(nèi)讀取結(jié)果。如滴加4滴樣本后，判讀窗口仍無(wú)紅色層析峰出現(xiàn)，補(bǔ)加1滴樣本，并重新開(kāi)始計(jì)時(shí)。肉眼觀察樣品檢測(cè)結(jié)果。

1.4.2 結(jié)果判定

石房蛤毒素膠體金快檢試紙卡結(jié)果判定示意圖如圖2所示。

陽(yáng)性：僅質(zhì)控區(qū)(C)有一條粉紅色帶出現(xiàn)，檢測(cè)區(qū)(T)無(wú)色帶出現(xiàn)。表明樣品中石房蛤毒素含量大于檢測(cè)限。判讀時(shí)間若超過(guò)10 min，陽(yáng)性樣品的T區(qū)可能會(huì)出現(xiàn)非常淺的色帶，也判定為陽(yáng)性。

陰性：質(zhì)控區(qū)(C)和檢測(cè)區(qū)(T)都有明顯的粉紅色帶出現(xiàn)。表明樣品中不含有石房蛤毒素或含量小于檢測(cè)限。

無(wú)效：質(zhì)控區(qū)(C)沒(méi)有色帶出現(xiàn)。表明操作過(guò)程不正確或試紙卡已失效，應(yīng)更換試紙卡重新測(cè)定。

注： C.質(zhì)控區(qū)；T.檢測(cè)區(qū)。

1.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

按照GB 5009.213—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 貝類(lèi)中麻痹性貝類(lèi)毒素的測(cè)定》中的LC-MS/MS法進(jìn)行樣品提取和凈化。

液相色譜條件：色譜柱為Atlantis Hilic Silica色譜柱，50.0 mm×2.1 mm，粒徑3.0 μm；流動(dòng)相：A為0.1%HCOOH，B為CH3CN，梯度洗脫條件見(jiàn)表1；流速：0.30 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2.0 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)，優(yōu)化參數(shù)見(jiàn)表2。

使用基質(zhì)加標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將基質(zhì)匹配的不同濃度工作液分別注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液中石房蛤毒素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測(cè)定。該方法的定量限為100.0 μg/kg。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions of mobile phase

表2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)優(yōu)化參數(shù)Tab.2 Optimization parameters of multi-reaction monitoring

1.6 試紙卡應(yīng)用測(cè)試

1.6.1 添標(biāo)樣品的制備

1 mg/mL石房蛤毒素儲(chǔ)備液：取石房蛤毒素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，加入1 mL 0.01 mol/L的PBS緩沖液溶解，于4 ℃保存。

10 μg/mL石房蛤毒素工作液：取1 mg/mL石房蛤毒素儲(chǔ)備液100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用去離子水定容至刻度，臨用前配制。

250 μg/kg添標(biāo)樣品：取10 μg/mL石房蛤毒素工作液125 μL加入5 g陰性貝類(lèi)樣品中混勻。

500 μg/kg添標(biāo)樣品：取10 μg/mL石房蛤毒素工作液250 μL加入5 g陰性貝類(lèi)樣品中混勻。

1 000 μg/kg添標(biāo)樣品：取10 μg/mL石房蛤毒素工作液500 μL加入5 g陰性貝類(lèi)樣品中混勻。

1.6.2 檢測(cè)限測(cè)定

取經(jīng)LC-MS/MS法確證為陰性的牡蠣、縊蟶和花蛤樣品，分別制備石房蛤毒素添標(biāo)濃度為0、250、500和1 000 μg/kg的樣品各10個(gè)，按照1.4膠體金快速檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)和判定。

1.6.3 假陽(yáng)性率和假陰性率測(cè)定

取經(jīng)LC-MS/MS法確證為陰性的牡蠣、縊蟶和花蛤樣品，分別制備10個(gè)石房蛤毒素添標(biāo)濃度小于或等于250 μg/kg的貝類(lèi)樣品(其中6個(gè)添標(biāo)濃度為0 μg/kg，4個(gè)添標(biāo)濃度為250 μg/kg)和10個(gè)石房蛤毒素添標(biāo)濃度大于或等于500 μg/kg的貝類(lèi)樣品(其中6個(gè)添標(biāo)濃度為500 μg/kg，4個(gè)添標(biāo)濃度為1 000 μg/kg)，按照1.4膠體金快速檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)和判定。同時(shí)分別以石房蛤毒素添標(biāo)濃度為0和500 μg/kg的貝類(lèi)樣品作為試紙卡陰性和陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算假陽(yáng)性率和假陰性率。

1.6.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

取牡蠣、貽貝、縊蟶、花蛤等貝類(lèi)樣品30個(gè)，同時(shí)按1.4膠體金快速檢測(cè)方法和LC-MS/MS法進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 試紙卡的檢測(cè)限

用試紙卡分別檢測(cè)石房蛤毒素添標(biāo)濃度為0、250、500和1 000 μg/kg的牡蠣樣品，結(jié)果見(jiàn)圖3。石房蛤毒素添標(biāo)濃度為0和250 μg/kg的樣品，C線和T線均可見(jiàn)，結(jié)果均為陰性；石房蛤毒素添標(biāo)濃度為500和1 000 μg/kg的樣品，C線均可見(jiàn)，T線均無(wú)顯色，結(jié)果均為陽(yáng)性。因此可確定該膠體金快速檢測(cè)試紙卡對(duì)貝類(lèi)樣品中石房蛤毒素的檢測(cè)限為500 μg/kg。

對(duì)于牡蠣、縊蟶、花蛤等3種貝類(lèi)樣品，當(dāng)石房蛤毒素含量低于250 μg/kg時(shí)陽(yáng)性檢出率為0%；當(dāng)石房蛤毒素含量高于500 μg/kg時(shí)陽(yáng)性檢出率為100%，試紙卡對(duì)添加不同濃度石房蛤毒素的樣品的檢測(cè)結(jié)果均一致，說(shuō)明該試紙卡在貝類(lèi)產(chǎn)品中具有普遍適用性。

2.2 假陽(yáng)性率和假陰性率

用試紙卡對(duì)石房蛤毒素添標(biāo)濃度小于或等于250 μg/kg的貝類(lèi)樣品進(jìn)行檢測(cè)，10個(gè)牡蠣、10個(gè)縊蟶和10個(gè)花蛤樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，故試紙卡的假陽(yáng)性率為0%。

用試紙卡對(duì)石房蛤毒素添標(biāo)濃度大于或等于500 μg/kg的貝類(lèi)樣品進(jìn)行檢測(cè)，10個(gè)牡蠣、10個(gè)縊蟶和10個(gè)花蛤樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，故試紙卡的假陰性率為0%。

2.3 實(shí)際應(yīng)用結(jié)果分析

分別用試紙卡和LC-MS/MS法檢測(cè)30個(gè)貝類(lèi)實(shí)際樣品中的石房蛤毒素，其中牡蠣10個(gè)、貽貝12個(gè)、縊蟶4個(gè)、花蛤4個(gè)，結(jié)果見(jiàn)表3。用LC-MS/MS法檢測(cè)時(shí)，各基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.99，具有良好的線性關(guān)系。

檢測(cè)結(jié)果顯示，30個(gè)貝類(lèi)樣品經(jīng)LC-MS/MS法檢測(cè)，有13個(gè)未檢出石房蛤毒素，17個(gè)檢出石房蛤毒素，其中10個(gè)樣品中石房蛤毒素含量小于500 μg/kg，7個(gè)樣品中石房蛤毒素含量大于500 μg/kg。30個(gè)貝類(lèi)樣品經(jīng)試紙卡檢測(cè)，23個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性，均為石房蛤毒素含量小于500 μg/kg的樣品；7個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，均為石房蛤毒素含量大于500 μg/kg的樣品，表明兩種檢測(cè)方法結(jié)果一致。

實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明，石房蛤毒素膠體金快速檢測(cè)試紙卡能檢測(cè)出石房蛤毒素大于500 μg/kg的貝類(lèi)樣品，且快速簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠，適用于貝類(lèi)樣品中石房蛤毒素的現(xiàn)場(chǎng)快檢，可以應(yīng)用于日常石房蛤毒素檢測(cè)篩查工作。

表3 試紙卡與LC-MS/MS法檢測(cè)貝類(lèi)樣品結(jié)果比較Tab.3 Comparison of the results of test strip and LC-MS/MS method in the detection of shellfish samples

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，正常生態(tài)平衡遭到破壞，沿海海域頻繁發(fā)生赤潮，給漁業(yè)生產(chǎn)和百姓健康造成了嚴(yán)重影響，麻痹性貝毒在我國(guó)沿海蔓延的潛在危險(xiǎn)不容忽視。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因誤食受麻痹性貝毒污染的貝類(lèi)產(chǎn)品而引發(fā)的中毒事件高達(dá)2 000余起，死亡率達(dá)15%。我國(guó)是貝類(lèi)養(yǎng)殖大國(guó)，牡蠣、貽貝、扇貝、蛤、蟶等養(yǎng)殖貝類(lèi)產(chǎn)品是我國(guó)水產(chǎn)品出口創(chuàng)匯的重要品種。歐盟和美國(guó)是世界上主要的貝類(lèi)消費(fèi)地區(qū)，也是我國(guó)貝類(lèi)產(chǎn)品的主要出口國(guó)，他們都非常重視貝類(lèi)安全衛(wèi)生的源頭管理，強(qiáng)調(diào)貝類(lèi)養(yǎng)殖環(huán)境的監(jiān)測(cè)與監(jiān)控。為推動(dòng)貝類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，保障赤潮期間貝類(lèi)質(zhì)量安全，促進(jìn)貝類(lèi)產(chǎn)品出口貿(mào)易，建立有效的貝毒快速檢測(cè)方法，對(duì)養(yǎng)殖貝類(lèi)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控是十分必要的。

當(dāng)前麻痹性貝毒的檢測(cè)方法可分為生物測(cè)定分析法、儀器分析法、免疫測(cè)定法和細(xì)胞毒性測(cè)定法等四類(lèi)。小白鼠生物測(cè)定法是美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)認(rèn)證的檢測(cè)PSP的標(biāo)準(zhǔn)生物技術(shù)方法，同時(shí)也是國(guó)際海產(chǎn)品貿(mào)易中的官方方法，目前包括我國(guó)在內(nèi)，世界上約有81%的國(guó)家使用該方法檢測(cè)PSP[14-15]。雖然小白鼠生物測(cè)定法在概括樣品毒性方面非常有效，但小鼠間的個(gè)體差異會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性不足，且實(shí)驗(yàn)耗材和前期準(zhǔn)備工作量都較大。高效液相色譜法(HPLC)是較早被應(yīng)用的儀器分析方法之一，與生物測(cè)定法相比，其更加準(zhǔn)確高效，專(zhuān)一性強(qiáng)、靈敏度高[16]；但檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，需要配備昂貴的儀器，且對(duì)操作人員的技術(shù)要求高，在基層應(yīng)用推廣中難以普及。酶聯(lián)免疫技術(shù)使用了抗原-抗體結(jié)合的原理，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)短，適合快速檢測(cè)篩查樣品；但制備多克隆抗體時(shí)需大量純化標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)成本較高[17]。細(xì)胞毒性試驗(yàn)是利用藜蘆堿激活神經(jīng)細(xì)胞的Na+通道，使Na+內(nèi)流，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外離子失調(diào)，引起神經(jīng)細(xì)胞死亡，而PSP是Na+通道阻滯劑，因此可通過(guò)對(duì)比計(jì)算細(xì)胞死亡率來(lái)測(cè)定PSP毒性[18]；但由于檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作繁瑣，需要培養(yǎng)較多細(xì)胞，所以該方法尚未在我國(guó)建立應(yīng)用。隨著麻痹性貝毒檢測(cè)實(shí)際應(yīng)用需求的不斷增長(zhǎng)，更加高效快捷、簡(jiǎn)便可靠、低成本的檢測(cè)方法仍是研究的主流趨勢(shì)。

膠體金快速檢測(cè)技術(shù)具有快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、容易學(xué)習(xí)的特點(diǎn)，非常適用于基層監(jiān)管部門(mén)開(kāi)展大批量的快速定性篩查檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊。為此，本研究對(duì)福建省水產(chǎn)研究所研制的石房蛤毒素膠體金快速檢測(cè)試紙卡進(jìn)行了應(yīng)用測(cè)試，結(jié)果表明，該試紙卡在貝類(lèi)產(chǎn)品中具有普遍適用性，對(duì)石房蛤毒素的檢測(cè)限為500 μg/kg，低于國(guó)際限量標(biāo)準(zhǔn)800 μg/kg；檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，單個(gè)樣品檢測(cè)耗時(shí)約20 min，僅需配備簡(jiǎn)單小型儀器即可，對(duì)檢測(cè)人員操作水平要求不高，能夠滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需要。雖然該試紙卡目前只能進(jìn)行定性檢測(cè)，但可作為有效的輔助檢測(cè)手段應(yīng)用于貝類(lèi)樣品的初篩檢測(cè)，能對(duì)行政指令性的監(jiān)督抽查工作起到良好的補(bǔ)充作用；同時(shí)有助于形成“快檢初篩+實(shí)驗(yàn)室確證”的科學(xué)監(jiān)管模式，彌補(bǔ)多年來(lái)赤潮災(zāi)害防范工作中麻痹性貝毒監(jiān)測(cè)技術(shù)手段的不足，對(duì)加強(qiáng)貝類(lèi)質(zhì)量安全監(jiān)管、提高海洋漁業(yè)赤潮防災(zāi)減災(zāi)能力、進(jìn)而保障漁業(yè)經(jīng)濟(jì)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。