李國基，胡 浪，李榮順，李大彪，楊 碩，邢媛媛，黃顯會

(1 華南農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院/廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣東 廣州 510642；2 金河生物科技股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010018；3 內蒙古農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

反芻動物瘤胃微生物系統(tǒng)是由細菌、古生菌、原蟲和厭氧真菌共同組成的復雜微生物群落系統(tǒng)，瘤胃微生物對反芻動物纖維飼料的消化及轉化為短鏈脂肪酸做出了較大貢獻[1-2]。當反芻動物感染并暴發(fā)病原性細菌性疾病—如犢牛腹瀉、奶牛乳房炎、羔羊痢疾及母羊流產(chǎn)等，注射抗生素或者口服抗生素類飼料添加劑對細菌性疾病的防治起到了相當重要的作用。但當抗生素對致病菌發(fā)揮抑制或殺滅作用的同時，對反芻動物瘤胃非病原性細菌也可能會產(chǎn)生殺滅或抑制作用[3]，同時瘤胃微生物對口服抗生素會有一定的降解作用。

近年來，由大腸埃希菌引起的細菌性腸炎及痢疾廣泛存在于反芻動物犢牛及羔羊中，每年由腹瀉及痢疾造成的羔羊及犢牛死淘率給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。金霉素屬于廣譜抗生素，具有高劑量殺菌及低劑量抑菌的效果，作為抗菌及促生長飼料添加劑在我國禽畜業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)中得到了廣泛使用，對養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有重要的促進作用。前期研究發(fā)現(xiàn)普通金霉素預混劑顆粒在反芻動物綿羊瘤胃液中釋放量較大[4]，說明其對瘤胃微生物的抑制作用可能也較大。廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室自主研制的反芻動物口服用金霉素微囊化顆粒在反芻動物瘤胃中的釋放量比普通金霉素預混劑顆粒少，且在皺胃能夠大量釋放，滿足反芻動物對金霉素的有效吸收，起到抑菌作用，表明其可能能夠減少金霉素對瘤胃微生物的抑制作用。因此本試驗將對反芻動物綿羊分別口服普通金霉素預混劑顆粒及金霉素微囊化顆粒后8種主要瘤胃微生物—瘤胃總細菌（Rumen general bacteria）、瘤胃厭氧真菌（Rumen anaerobic fungi）、白色瘤胃球菌Ruminococcusalbus、黃化瘤胃球菌Ruminococcus flavefaciens、產(chǎn)琥珀酸擬桿菌Fibrobacter succinogens、牛鏈球菌Streptococcusbovis、普雷沃氏菌屬Prevotellaspp.、溶纖維丁酸弧菌Butyrivibrio fibrisolvens的數(shù)量變化進行分析比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 金霉素微囊化顆粒制劑：金霉素含量為10% (w)，由廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室與金河生物科技股份有限公司共同研制；金霉素預混劑顆粒：金霉素含量為22.7%(w)，批號20180326，由金河生物科技股份有限公司提供；PMD-19T克隆試劑盒、質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、RNA 酶、DNA premix 擴增酶、DL2000 marker、6×Loading buffer、核酸染料、TOP 10 感受態(tài)細胞、熒光定量試劑盒購自寶生物工程有限公司。

1.1.2 主要儀器 MAXQ4000 恒溫搖床和 Mach 1.6R冷凍離心機購自美國賽默飛世爾科技公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科技有限公司；SX-500高壓鍋、NanoDrop 2000酶標儀和G:BOX凝膠成像儀器購自基因有限公司；HH-2恒溫水浴鍋購于國華電器有限公司；CFX96 RT-PCR儀購于Bio-Rad公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配制 LB 液體培養(yǎng)基：準確稱取 5 g酵母提取物、10 g 胰蛋白胨及 10 g 氯化鈉于 1 L 錐形瓶中，加入950 mL去離子水后攪拌溶解，用5 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH為7.0后，加入去離子水定容至 1 L，121 ℃ 條件下高壓滅菌 15 min，于潔凈臺冷卻，4 ℃保存。

LB/Amp/IPTG/X-Gal固體培養(yǎng)基：準確稱取5 g酵母提取物、10 g 胰蛋白胨及 10 g 氯化鈉于 1 L 錐形瓶中，加入950 mL去離子水后攪拌溶解，用5 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH為7.0后，加入去離子水定容至 1 L，121 ℃ 條件下高壓滅菌 15 min。冷卻至 55～60 ℃ 左右，加入 1 mL Amp (100 mg/mL)、0.48 mL IPTG 及 0.80 mL X-Gal后混勻，快速倒入培養(yǎng)皿中，于潔凈臺冷卻凝固，4 ℃保存。

1.1.4 試驗動物 體質量（29.0±2.3） kg、體況良好、6月齡左右的18只綿羊購于內蒙古呼和浩特托克托縣某示范羊場。試驗動物飼喂的飼糧精粗料質量比為3∶7，其中精料為內蒙古正大羊育肥料(內蒙古正大有限公司)，粗料為青干草且均不含藥物及抗生素。每天按照試驗動物正常采食量投放精料，待精料吃完后再投放粗料。試驗動物飼糧的營養(yǎng)水平(w)為有機物92.70%、干物質94.52%、粗蛋白質14.33%、酸性洗滌纖維24.76%、中性洗滌纖維47.30%、鈣0.89%、磷0.42%。試驗動物每天飼喂2次(09：00左右及17：00左右)，自由飲水。羊舍環(huán)境及綿羊飼養(yǎng)管理均在統(tǒng)一試驗水平條件下進行，所有試驗動物均單代謝籠飼喂，且動物房保持通風。18頭綿羊統(tǒng)一飼喂相同配比的粗精料15 d且體況均表現(xiàn)正常后，開始正式試驗。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物與試驗設計 試驗于2019年1月10日在內蒙古呼和浩特托克托縣某示范羊場進行。所有試驗動物統(tǒng)一飼養(yǎng)15 d后，隨機分為6組，每組3只，包括1個空白對照組（CK）和5個給藥組?？瞻讓φ战M的綿羊只飼喂基礎飼糧，5個給藥組綿羊的具體處理如下。試驗I組：飼喂基礎飼糧和普通金霉素預混劑顆粒；試驗II組：飼喂基礎飼糧和氫化油處方組金霉素微囊化顆粒；試驗III組：飼喂基礎飼糧和PEG4000/單甘脂處方組金霉素微囊化顆粒，輔料PEG4000和輔料單甘脂的質量比為5︰5，試驗IV組：飼喂基礎飼糧和氫化油/單甘脂處方組金霉素微囊化顆粒,輔料氫化油和輔料單甘脂的質量比為9︰1；試驗V組：飼喂基礎飼糧和氫化油/單甘脂處方組金霉素微囊化顆粒，輔料氫化油和輔料單甘脂的質量比為8︰2。

1.2.2 給藥與樣本采集 5個給藥組按照每頭綿羊的單位體質量進行灌胃給藥，金霉素的給藥劑量均為25 mg/kg，每天給藥1次且均在晨飼前灌胃給藥。連續(xù)給藥5 d后對6組綿羊進行瘤胃食糜采集，采集的瘤胃食糜均迅速經(jīng)4層紗布過濾，保留濾液于液氮中，?80 ℃保存。

1.2.3 瘤胃液基因組總DNA提取 將瘤胃液樣品從?80 ℃冰箱取出后于冰上解凍，根據(jù)李子健[5]及劉薇等[6]提供的CTAB法提取瘤胃液基因組DNA。

1.2.4 DNA 的檢測 配制 10 g/L 的瓊脂糖凝膠，對所提瘤胃微生物總基因組DNA進行檢測，同時用酶標儀檢測所提 DNA 的濃度及D260 nm、D280 nm值。

1.2.5 瘤胃微生物引物設計 瘤胃微生物引物均在華大基因合成，引物序列見表1。

1.2.6 目的基因的擴增參數(shù)及擴增體系 PCR預變性參數(shù)為 94 ℃ 5 min；擴增參數(shù)為 94 ℃ 變性 30 s，55～60 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 40 s，40 次循環(huán)；延長參數(shù)為 72 ℃ 5 min；保溫溫度為 4 ℃?？偡磻w系為 25 μL：DNA 模板 2.0 μL、上下游引物各 1.0 μL、DNA 聚合酶 12.5 μL、滅菌超純水 8.5 μL。

1.2.7 目標片段膠回收 PCR 擴增產(chǎn)物首先用 10 g/L 瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，目標片段合格后切膠回收。

1.2.8 PCR擴增產(chǎn)物的克隆連接體系 連接體系為 10 μL，包括膠回收產(chǎn)物 4 μL、克隆載體 1 μL 和Solution I 5 μL，于 16 ℃ 條件下連接 7 h 左右。

1.2.9 PCR 擴增產(chǎn)物的克隆陽性質粒轉化 將 10 μL連接產(chǎn)物全部加入 50 μL TOP 10 感受態(tài)細胞中，于冰中靜置 30 min 后轉入 42 ℃ 水浴鍋中，90 s后快速轉移到冰中靜置2 min左右后再轉至300 μL不含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，在水浴搖床中振蕩培養(yǎng)1 h 進行復蘇，復蘇培養(yǎng)條件為 37 ℃、160～200 r/min。之后將復蘇菌液涂布于含有抗生素及顯色底物的LB固體培養(yǎng)基上，最后于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h。

1.2.10 質粒標準品制備 挑選單個白色菌落接種至含有抗生素的4 mL LB液體培養(yǎng)基中進行復蘇培養(yǎng)，復蘇條件為 37 ℃、160～200 r/min。復蘇培養(yǎng)12～16 h后，對菌液進行PCR陽性鑒定，鑒定為陽性者委托華大基因進行單向測序。將測序結果在NCBI比對，相似性在95%以上方可進行質粒提取。

表 1 瘤胃微生物PCR擴增引物Table 1 PCR amplification primers of ruminal microbes

1.2.11 熒光定量PCR標準曲線制備 將質粒標準品以10倍濃度進行稀釋，稀釋濃度梯度不少于5個，每個梯度設置3次重復。熒光定量PCR結束后，根據(jù)熒光定量儀中的Eco軟件獲得質?？截悢?shù)與Ct值對應的線性關系，制備質粒標準曲線。

1.2.12 待測樣品熒光定量分析 樣品和質粒標準品的 PCR 反應體系均為 10 μL，包括模板1 μL、上下游引物各 0.5 μL、滅菌超純水 3 μL、熒光定量試劑盒混合體系5 μL。各細菌RT-PCR擴增參數(shù)均與普通PCR擴增參數(shù)相同，其中熔解參數(shù)為95 ℃ 15 s，55～60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。絕對定量前將待測樣品統(tǒng)一稀釋到10 ng/μL，將待測樣品Ct值帶入相應標準曲線得到菌群拷貝數(shù)，菌群拷貝數(shù)計算公式參考李大彪等[11]的研究。菌群數(shù)量最終采用1 mL樣品中16S rDNA拷貝數(shù)的常用對數(shù)值表示。

1.2.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 運用 SAS 9.2 中 GLM 程序，采用Duncan’s法對熒光定量數(shù)據(jù)結果進行多重比較方差分析，差異顯著性判斷標準為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 樣品基因組總DNA提取結果

粗提瘤胃液總 DNA 中，D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0 之間，質量濃度在 152～897 ng/μL 之間，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，目的條帶均位于2 000 bp以上，說明所提瘤胃總DNA純度較高，濃度較大，目的條帶大小正確。粗提總DNA的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。

圖 1 瘤胃液基因組DNA凝膠圖Fig.1 Electrophoretogram of rumen fluid genomic DNA

2.2 目的基因PCR擴增結果

8種瘤胃微生物經(jīng)普通PCR擴增后進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，檢測后發(fā)現(xiàn)各目的條帶均與預測條帶一致，無非特異性擴增條帶，說明可進行下一步試驗。瘤胃厭氧真菌及其他7種瘤胃細菌普通PCR擴增結果見圖2。

2.3 藍白斑篩選結果

目的基因連接轉化后均勻涂布于含顯色底物及Amp的固體平板培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h后，培養(yǎng)基上均長出藍、白色單克隆菌，且單克隆菌落間界限清晰，顯色明顯，可進行單個白色重組質粒菌落篩選，用于下一步試驗。部分目的基因藍白篩選見圖3。

圖 2 8種瘤胃微生物的普通PCR擴增結果Fig.2 Normal PCR amplification results of eight kinds of ruminal microbes

2.4 菌液PCR鑒定結果

8種瘤胃微生物菌液目標條帶與預測條帶基本一致（圖4），說明膠回收產(chǎn)物與克隆載體連接成功，成功構建了含有目標片段的重組質粒，可送檢測序。

2.5 陽性克隆測序結果

將8種瘤胃微生物測序結果在NCBI(GenBank)上比對，結果顯示8種瘤胃微生物目的片段序列與文庫菌株相似性在95%～100%之間，表明成功構建了帶有目的片段的重組質粒，能進行8種瘤胃微生物質粒標準品的制備。

2.6 重組質粒的標準曲線及擴增和熔解曲線結果

8種瘤胃微生物標準曲線的相關系數(shù)均在0.99以上，且斜率在?3.75～?3.20范圍內，表明拷貝數(shù)的對數(shù)值與Ct值之間呈較好的線性關系，符合熒光定量PCR反應要求；8種瘤胃微生物熒光定量PCR擴增效率在85%～105%之間，從擴增曲線可以看出均檢測出了樣本熒光信號。同時從熔解曲線可以看出退火溫度單一，表明PCR產(chǎn)物特異性較強。以上結果均表明熒光定量結果符合要求，能夠用于定量分析。部分圖譜見圖5、6、7。

圖 3 部分目的基因藍白篩選圖Fig.3 White-blue plaque selection of partial target gene

圖 4 8種瘤胃微生物菌液PCR擴增Fig.4 Bacterial fluid PCR amplification of eight kinds of ruminal microbes

圖 5 瘤胃厭氧真菌和瘤胃總細菌標準曲線Fig.5 Standard curves of rumen anaerobic fungi and rumen general bacteria

圖 6 瘤胃厭氧真菌和瘤胃總細菌擴增曲線Fig.6 Amplification curves of rumen anaerobic fungi and rumen general bacteria

圖 7 瘤胃厭氧真菌和瘤胃總細菌熔解曲線Fig.7 Melt curves of rumen anaerobic fungi and rumen general bacteria

2.7 普通金霉素預混劑顆粒及4種金霉素微囊化顆粒對綿羊瘤胃微生物數(shù)量的影響

普通金霉素預混劑顆粒和4組金霉素微囊化顆粒均會對瘤胃微生物菌群數(shù)量產(chǎn)生一定影響(表2)。相對于空白對照組，氫化油/單甘脂(質量比為9︰1)處方組金霉素微囊化顆粒及PEG4000/單甘脂(質量比為5︰5)處方組金霉素微囊化顆粒分別只對牛鏈球菌及產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的數(shù)量有降低趨勢(P<0.05)。普通金霉素預混劑顆粒、氫化油處方組金霉素微囊化顆粒以及氫化油/單甘脂(質量比為8︰2)處方組金霉素微囊化顆粒對多種瘤胃微生物菌群數(shù)量均有降低的趨勢(P<0.05)，其中普通金霉素預混劑顆粒和氫化油/單甘脂(質量比為8︰2)處方組金霉素微囊化顆粒對產(chǎn)琥珀酸擬桿菌及牛鏈球菌數(shù)量有降低趨勢(P<0.05)，而氫化油處方組金霉素微囊化顆粒對三大綿羊瘤胃纖維降解菌（產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、白色瘤胃球菌、黃化瘤胃球菌）以及牛鏈球菌數(shù)量均有降低趨勢(P<0.05)。因此，氫化油/單甘脂(質量比為9︰1)處方組及PEG4000/單甘脂(質量比為5︰5)處方組金霉素微囊化顆粒有相對較好的效果。

與普通金霉素預混劑顆粒相比，氫化油處方組金霉素微囊化顆粒對黃化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的數(shù)量有更大的降低趨勢(P<0.05)；PEG4000/單甘脂(質量比為5︰5)處方組金霉素微囊化顆粒對溶纖維丁酸弧菌有增加趨勢(P<0.05)；氫化油/單甘脂(質量比為8︰2)處方組金霉素微囊化顆粒處理的各微生物菌群數(shù)量均未有明顯變化；氫化油/單甘脂(質量比為9︰1)處方組金霉素微囊化顆粒顯著增加了產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的數(shù)量(P<0.05)，對其他幾種瘤胃微生物菌群數(shù)量影響均不顯著(P>0.05)；因此，氫化油/單甘脂(質量比為9︰1)處方組金霉素微囊化顆粒相對普通金霉素預混劑顆粒有較好的效果。

表 2 普通金霉素預混劑顆粒及4種金霉素微囊化顆粒對綿羊瘤胃微生物數(shù)量的影響Table 2 Effects of normal chlortetracycline premix granule and four kinds of chlortetracycline microcapsules on the quantity of ruminal microbe of sheep

3 討論與結論

金霉素屬于廣譜抗生素，對大部分革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、立克次體、支原體、衣原體以及阿米巴原蟲等均有抑制效果。從20世紀80年代開始，飼料級金霉素就在我國作為抗菌、促生長飼料添加劑使用[12-13]。目前FDA已批準金霉素預混劑顆粒用于多種動物細菌性疾病的臨床防治，其中在反芻動物臨床應用中主要用于牛，治療大腸埃希菌和沙門氏菌引起的牛細菌性腸炎，以及多殺性巴氏桿菌引起的牛細菌性肺炎，每天給藥劑量約22 mg/kg，且給藥時間不超過5 d，尚未批準用于治療大腸埃希菌及沙門氏菌引起的綿羊細菌性腹瀉疾病。本研究認為可能是治療大腸埃希菌引起的綿羊腹瀉所需的普通金霉素預混劑顆粒的劑量較大，綿羊口服大劑量的普通金霉素預混劑顆粒對瘤胃微生物抑制作用也較大，因此FDA暫未批準金霉素預混劑顆粒用于綿羊細菌性疾病的治療。本試驗在給藥劑量及療程上參考普通金霉素預混劑顆粒治療由大腸埃希菌引起的牛細菌性腹瀉的劑量及療程，普通金霉素預混劑顆粒及金霉素微囊化顆粒給藥劑量均定為每天 25 mg/kg，給藥療程均為 5 d，分析比較普通金霉素預混劑顆粒及自主研制的4種金霉素微囊化顆粒對綿羊瘤胃微生物菌群的影響。

為了降低反芻動物口服抗生素后對瘤胃微生物的影響，近年來國內開展了反芻動物口服抗生素微囊化制劑的研究試驗，如反芻動物口服恩諾沙星微囊顆粒的研制[14]及過瘤胃包被恩諾沙星微丸的制備等[15]，但此類研究相對較少，且國內外關于反芻動物口服金霉素微囊顆粒制劑的研究報道也較少。對于反芻動物口服普通金霉素顆粒劑對瘤胃微生物的影響，國外學者進行了大批量試驗。Turner等[16]選取3頭體質量在27.7～31.8 kg之間的綿羊，按每頭750 mg普通鹽酸金霉素顆粒(約23.6～27.1 mg/kg)的劑量口服灌胃給藥，發(fā)現(xiàn) 2 h后3頭綿羊瘤胃總細菌數(shù)量均減少到了75%左右，2 d后瘤胃總細菌數(shù)量才逐漸恢復；Lodge等[17]發(fā)現(xiàn)長時間在飼料中按照每頭肉牛240 mg/d及80 mg/d的劑量添加普通金霉素顆粒均會降低肉牛瘤胃纖維消化率；另有研究表明長時間口服普通金霉素預混劑顆粒會造成小肉牛瘤胃細菌菌群紊亂、食欲下降、個體瘤胃兼性厭氧菌增加和纖維消化細菌減少等[18]。以上研究均表明反芻動物長時間大劑量口服普通金霉素顆粒會對其瘤胃微生物菌群造成不良影響。

考慮到不同粗精比日糧對反芻動物瘤胃微生物菌群的多樣性及細菌數(shù)量影響較大[19-22]，為了減少試驗結果誤差，18頭綿羊統(tǒng)一飼喂相同配比的粗精料15 d且體況均表現(xiàn)正常后，再開始正式試驗。羊、牛等反芻動物能夠有效消化吸收纖維類植物飼料并將其轉化為自身主要能量來源，得益于反芻動物自身瘤胃微生物菌群對纖維類植物的消化降解作用，其中起主要作用的優(yōu)勢菌株為白色瘤胃球菌、黃化瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸擬桿菌三大瘤胃纖維分解菌[23-24]。另外還有溶纖維丁酸弧菌[25]和牛鏈球菌[26-27]等綿羊瘤胃細菌以及瘤胃真菌[28]等也被證明對纖維的分解起一定作用。本試驗主要研究了反芻動物口服普通金霉素預混劑顆粒及4種金霉素微囊化顆粒對瘤胃厭氧真菌及7種瘤胃細菌數(shù)量的影響。Koike等[8, 29]及 Michalet-Doreau 等[30]研究表明，產(chǎn)琥珀酸擬桿菌在3種主要瘤胃纖維分解菌中在數(shù)量上占絕對優(yōu)勢，比黃化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌高1～2個數(shù)量級。本試驗結果中，空白對照組綿羊產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、黃化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌數(shù)量的數(shù)量級分別為1010、109和108，產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量分別比黃化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌數(shù)量高1～2個數(shù)量級，與前期研究結果一致，證實了本試驗定量結果的真實準確性。在普通金霉素預混劑顆粒和4組金霉素微囊化顆粒對瘤胃微生物數(shù)量影響的研究中，與空白對照組相比，普通金霉素預混劑顆粒組和4種金霉素微囊化顆粒組綿羊的瘤胃總細菌、瘤胃真菌以及普雷沃氏菌屬數(shù)量均未發(fā)生顯著變化(P＞0.05)，其中瘤胃總細菌的數(shù)量變化與Munch-Petersen等[18]在飼料中加入普通金霉素預混劑顆粒后瘤胃總細菌數(shù)量增加的結果有所不同。

普通金霉素預混劑顆粒及4種金霉素微囊化顆粒均或多或少使瘤胃微生物數(shù)量產(chǎn)生變化，但相對于普通金霉素預混劑顆粒和其他3種金霉素微囊化顆粒，氫化油/單甘脂(質量比為9︰1)處方組金霉素微囊化顆粒對綿羊瘤胃微生物數(shù)量的抑制作用較小。因此本試驗結果可為金霉素微囊化顆粒制劑處方的進一步篩選提供科學合理的數(shù)據(jù)，同時也能為下一步臨床試驗研究提供參考。