趙巴根那，烏云高娃，金 剛，那 坤

(1內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院·內(nèi)蒙古 通遼 028000；2北京小湯山醫(yī)院·北京 102211)

膝骨性關(guān)節(jié)炎主要通過(guò)降解軟骨，侵犯關(guān)節(jié)滑膜造成機(jī)體損傷[1]。其臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)部位腫痛、畸形和活動(dòng)被限制，后期多數(shù)伴有關(guān)節(jié)腔隙變窄、關(guān)節(jié)邊沿及骨刺形成，可造成關(guān)節(jié)僵硬，嚴(yán)重影響患者身心健康。隨著人口老齡化社會(huì)進(jìn)展，骨性關(guān)節(jié)炎的患者不斷增加，而膝關(guān)節(jié)是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病最常見的部位[2]，因此國(guó)內(nèi)外對(duì)于膝骨性關(guān)節(jié)炎的防治研究十分重視。蒙醫(yī)藥在防治膝骨性關(guān)節(jié)炎方面有著悠久的歷史和良好的療效，具有較好的研究前景[3]。森登-4味湯在臨床使用多年，對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎有良好的療效，有多項(xiàng)研究指出蒙藥森登-4味湯能緩解骨性關(guān)節(jié)炎的炎癥狀況，但其治療作用及作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)觀察了蒙藥森登-4味湯對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎家兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面變化及軟骨組織MMP-1(基質(zhì)金屬蛋白酶-1)、TIMP-1(基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1)蛋白表達(dá)的影響，探討蒙藥森登-4味湯對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用及作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年家兔80只，清潔級(jí)，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(吉) 2016-001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保持合理的明暗周期，明期6：30-18：30，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 藥物 森登-4味湯：由文冠木、訶子、梔子、川楝子等藥味組成，內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥藥房供應(yīng)。

1.3 試劑和儀器 MMP-1—抗兔多克隆抗體、TIMP-1—抗兔多克隆抗體、羊抗兔IgG：武漢博士德生物科技責(zé)任公司；Western blot技術(shù)所需的設(shè)備與材料由內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院提供。AUY-120電子天平(max 201g d=0.01mg)：日本島津公司；Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)；SDS-PAGE凝膠電泳儀。

2 方法

2.1 模型制備與分組處理 80只成年家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)選出64只采用改良Hulth法[4]進(jìn)行造模。實(shí)驗(yàn)兔編號(hào)，用30 g/L戊巴比妥鈉于耳緣靜脈注射進(jìn)行麻醉(30 mg/kg)，將兔雙膝伸直位固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)剃毛、消毒、鋪巾；在家兔右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱向切口長(zhǎng)約2.0～2.5 cm，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及完整摘除內(nèi)側(cè)半月板；隨后止血、縫合，常規(guī)包扎。手術(shù)過(guò)程中應(yīng)謹(jǐn)慎注意不損傷關(guān)節(jié)軟骨面，術(shù)后每只家兔注射青霉素40萬(wàn)U/d連續(xù)7 d，以預(yù)防術(shù)后引起的感染[5]。隨后進(jìn)行每天3次驅(qū)趕，每次驅(qū)趕時(shí)間至少30 min，4周后造模成功。將造模成功的64只家兔隨機(jī)分為4組： 模型組(16只)、森登-4味湯高劑量組(16只)、森登-4味湯中劑量組(16只)、森登-4味湯低劑量組組(16只)，另取16只正常家兔作為正常對(duì)照組。森登-4味湯高劑量組灌胃劑量為 45 mg/(kg·d);森登-4味湯中劑量組灌胃劑量為 30 mg/(kg·d)；森登-4味湯低劑量組灌胃劑量為 15 mg/(kg·d)；模型組等量蒸餾水灌胃，正常對(duì)照組則照常飼養(yǎng)，不作任何處理，給藥時(shí)間為4周。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 末次灌胃結(jié)束后，立刻將全部家兔處死，無(wú)菌手術(shù)下打開膝關(guān)節(jié)，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

2.2.1 關(guān)節(jié)面大體觀察 每組各取6只大體觀測(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面的變化，按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分[5]。關(guān)節(jié)面平整 ：0分；關(guān)節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗：1分；關(guān)節(jié)面光滑度差，軟骨欠缺深度到達(dá)一半：2分；關(guān)節(jié)發(fā)生潰爛，軟骨缺損變極少：3分；軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)外露：4分。

2.2.2 Western blot檢測(cè)兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-1和TIMP-1蛋白表達(dá) 取股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端部分軟骨組織在冰面上低溫狀態(tài)下制作勻漿、離心，編號(hào)放入塑料離心管內(nèi)，封閉，-80 ℃冷凍。細(xì)胞裂解法提取兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白含量后，制作凝膠點(diǎn)樣本，用電泳儀轉(zhuǎn)移蛋白到濃縮膠上，用轉(zhuǎn)移電泳槽轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，孵一抗2 h、孵二抗室溫過(guò)夜，加入A、B顯色酶顯色。最后用Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

3 結(jié)果

3.1 各組家兔關(guān)節(jié)面大體觀察結(jié)果 正常組動(dòng)物關(guān)節(jié)面平整，光滑度較好；模型組關(guān)節(jié)軟骨主要出現(xiàn)潰爛、軟骨剝脫、軟骨下骨質(zhì)外露。蒙藥森登-4味湯低劑量組、中劑量組和高劑量組膝關(guān)節(jié)大體評(píng)分明顯低于模型組，有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組家兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面評(píng)分比較分)

3.2 各組家兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-1、TIMP-1蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果 見表2。

表2 各組家兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-1、TIMP-1蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果比較

模型組與正常組比較，模型組MMP-1、TIMP-1蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，森登-4味湯各劑量組MMP-1明顯下調(diào)，TIMP-1蛋白表達(dá)均明顯增加，中劑量組和高劑量組明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)；中劑量組與高劑量組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。

4 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是伴有機(jī)械異常的常見關(guān)節(jié)疾病，關(guān)節(jié)軟骨降解是KOA的重要病理標(biāo)志[7]。膝骨性關(guān)節(jié)炎盡管病因繁多，但往往都是因?yàn)楦蓴_軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)造成軟骨細(xì)胞受損、使軟骨基質(zhì)降解超標(biāo)而發(fā)病[8]。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)的生成與分解失衡是 KOA軟骨退變的罪魁禍?zhǔn)住．?dāng)下，多項(xiàng)研究表明 MMPs可能在其中起不可忽視的作用。MMPs 除能降解多糖以外，還能降解所有細(xì)胞外基質(zhì)成分[9]。TIMPs 是MMPs的特異的抑制劑，廣泛存在廣泛結(jié)締組織中，可抑制所有膠原酶的活性。正常情況下，TIMPs可與 MMPs形成不可逆的1∶1非共價(jià)鍵結(jié)合，維持著軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的相對(duì)平衡 ，MMPs的異常增高，或者M(jìn)MPs與TIMPs兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡的失調(diào)，已成為研究KOA發(fā)病機(jī)制的重要靶點(diǎn)[10]。蒙藥森登-4味湯由文冠木、訶子、梔子、川楝子等藥味組成，有著清熱燥黃水的功能，主治痛風(fēng)、痹病、關(guān)節(jié)黃水病、關(guān)節(jié)水腫等。在臨床上廣泛用于治療關(guān)節(jié)炎及水腫等病癥。近年來(lái)有關(guān)森登-4味湯研究較多，國(guó)內(nèi)許多研究表明具有顯著的抗炎作用[11]，但具體抗炎機(jī)制尚未明確。本研究中發(fā)現(xiàn)TIMP-1、MMP-1在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型組動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織中有異常升高的現(xiàn)象。森登-4味湯灌胃治療后動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織中 MMP-1、蛋白表達(dá)明顯低于模型組,TIMP-1表達(dá)高于模型組。推斷TIMP-1、MMP-1蛋白的異常表達(dá)或者TIMP-1、MMP-1二者之間的失衡是膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制之一。蒙藥森登-4味湯可能是通過(guò)抑制和調(diào)節(jié)TIMP-1、MMP-1的表達(dá)保護(hù)關(guān)節(jié)起到治療作用。