曾 超，陳 靜，劉文兵，李 輝，王 靜，馬睿杰

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院·浙江 杭州 310012)

目前已經(jīng)明確，溶栓治療性血管再通及自然再通(血管側(cè)枝建立)的再灌注后，產(chǎn)生嚴(yán)重的缺血性再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[1-2]。損傷機(jī)制主要為活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和自由基的大量產(chǎn)生，使得超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等酶的清除能力有限[3-4]。針灸治療在腦血管疾病治療方面應(yīng)用廣泛，其機(jī)制研究目前均致力于針刺干預(yù)對(duì)腦血管疾病氧化反應(yīng)的某些環(huán)節(jié)，清除已經(jīng)形成的氧化物質(zhì)，對(duì)氧化反應(yīng)上游靶點(diǎn)的研究及調(diào)節(jié)通路研究甚少。本研究從ROS產(chǎn)生的主要來源，氧化應(yīng)激的上游靶點(diǎn)即還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate 0xidase，NOX)，如何參與腦損傷的發(fā)生以及其對(duì)神經(jīng)元的作用機(jī)制角度進(jìn)行研究，其中NOX催化亞單位NOX2/gp91phox與缺血性腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[5-6]；并采用敲除此基因片段的小鼠作為陽性對(duì)照組，從更相似更平行的機(jī)理角度去揭示電針的抗氧化機(jī)制，運(yùn)用生物科技手段開創(chuàng)針刺治療腦血管疾病的一個(gè)嶄新研究領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、模型制備及分組 健康雄性7～9周齡C57/BL6野生型小鼠120只，體質(zhì)量(25.30±2.50)g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016。gp91phox基因敲除組(以下文簡(jiǎn)稱基因組)小鼠30只，體質(zhì)量(23.40±2.02)g，購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究。120 只C57/BL6小鼠和30 只基因敲除小鼠均按照經(jīng)典的Zea-Longa改良線栓法[7]制備小鼠I/R模型。動(dòng)物成模后按體質(zhì)量編號(hào)后隨機(jī)分為：3、24、48 h 3個(gè)大組(基因組用特殊的記號(hào)筆標(biāo)識(shí))，每個(gè)大組又分為模型組、電針組、藥物組、基因組4個(gè)小組，每組10只，另按各時(shí)間點(diǎn)設(shè)假手術(shù)組，每組10 只。

1.2 藥物、試劑與儀器 夾竹桃麻素(Apocynin)：浙江常青化工有限公司。二甲亞砜(DMSO)：浙江常青化工有限公司；電泳級(jí)瓊脂糖：上海東海制藥廠；NADPH試劑盒：Sigma-Aldrich；光澤精： Sigma-Aldrich。PeriFlux 5000激光多普勒組織血流檢測(cè)儀器：瑞典百靈威中國(guó)公司；HANS-200E韓氏穴位神經(jīng)刺激儀：北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司；華佗牌15 mm毫針：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；CFX96 PCR儀：美國(guó)伯樂；TG16-WS高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 干預(yù)方法 假手術(shù)組：給予相同的抓取處理，不造模；模型組給予I/R造模；基因組：I/R造模；藥物組：選用NOX特異性抑制劑 Apocynin 溶于DMSO，按 50 mg /kg劑量于再灌注后3、24、48 h行腹腔注射[8]，注射結(jié)束即用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈放血，剪下大腦，置于冰臺(tái)上快速取出右側(cè)大腦組織，于-80 ℃冰箱中備用；電針組：將小鼠用鼠帶捆綁束縛，但不影響小鼠的正常生命活動(dòng)為度，再灌注3、24、48 h將15 mm毫針刺入督脈腧穴“百會(huì)”“大椎”(穴位定位參照華興邦[9]所作“大鼠定位圖譜的研制”)，刺入穴位后，接韓氏電針儀，輸出電流1～3 mA，以小鼠安靜耐受、針體輕輕抖動(dòng)為宜，頻率15 Hz，連續(xù)波，時(shí)間30 min；留針時(shí)間結(jié)束后，取腦組織，方法同藥物組方法。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 參照Zea-Longa的評(píng)分方法[10]，I/R模型完成(即再灌注)即刻、再灌注后3、24、48 h(干預(yù)后)觀察并記錄神經(jīng)功能缺損評(píng)分。無神經(jīng)病學(xué)征象為0分；提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直為1分；向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)征象為2分；向病灶對(duì)側(cè)跌倒為3分；無自發(fā)活動(dòng)及意識(shí)障礙為4分。

1.4.2 rCBF檢測(cè) 采用激光多普勒組織血流儀檢測(cè)[11]。具體方法：在大腦右側(cè)的眼角和外耳道中間(大腦中動(dòng)脈區(qū)域)分離肌肉暴露顱骨，運(yùn)用自制的簡(jiǎn)易探頭黏貼于骨面上，將激光多普勒探針插入探頭內(nèi)便可以進(jìn)行微血管血流的測(cè)控，分別觀察并記錄小鼠缺血前、缺血即刻(達(dá)到缺血前30%即認(rèn)為造模成功[12])，再灌注即刻和再灌注后3、24、48 h各時(shí)相的腦血流值，每個(gè)時(shí)相值均維持平穩(wěn)后3 min左右。

1.4.3 光澤精增強(qiáng)發(fā)光法檢測(cè)NOX活性 腦組織勻漿并離心，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，NADPH氧化酶的測(cè)定要加入其作用底物NADPH(10-4mol/L)和光澤精(5×10-6mol/L)，當(dāng)加入含有25～50 μg蛋白的組織上清液10～20 μL后反應(yīng)開始，酶活性以每毫克蛋白每分鐘的毫摩爾數(shù)表示[13]。

1.4.4 半定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)NOX2/gp91phox表達(dá) 大腦總mRNA提取按文獻(xiàn)方法[14]進(jìn)行，PCR上、下游引物通過網(wǎng)站(www.genome.wi.mit.edu)提供的引物設(shè)計(jì)程序(primer 3.0)設(shè)計(jì)。PCR 擴(kuò)增：NOX2/gp91phox反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，53.5 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)28 次，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。上述PCR 產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳。凝膠在紫外燈下觀察，即時(shí)成像相機(jī)拍照。利用計(jì)算機(jī)輔助的圖像分析儀掃描，進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)I/R小鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響 見表1。

表1 各組小鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較分)

2.2 電針對(duì)I/R小鼠腦血流的影響 見表2。

表2 各組小鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)腦血流值測(cè)定結(jié)果比較

2.3 電針對(duì)I/R小鼠腦組織NOX活性的影響 見表3。

表3 各組小鼠腦組織不同時(shí)間點(diǎn)NOX活性的比較

2.4 電針對(duì)I/R小鼠腦組織NOX2/gp91phox表達(dá)的影響 見圖1，表4。

圖1 各組小鼠腦組織不同時(shí)間點(diǎn)NOX2/gp91phox表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

表4 各組小鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)腦組織NOX2/gp91phox表達(dá)的比較

3 討論

腦缺血性損傷的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜, 其中腦細(xì)胞能量代謝障礙與代謝性酸中毒、炎癥反應(yīng)及自由基損傷是其重要的損傷機(jī)制[15]。NOX是ROS產(chǎn)生的主要來源，NADPH 氧化酶是由 p40phox、p47phox、p67phox、p22phox和 gp91phox(即NOX2)等 5 個(gè)亞基組成的膜結(jié)合蛋白[5-6]。其同源物主要包括 NOX2，NOX1，NOX3，NOX4 和 NOX5。 gp91phox和p22phox亞基位于質(zhì)膜上，p47phox，p67phox，p40phox和Rac亞基位于胞漿內(nèi)。gp91phox是其主要的功能亞基即催化亞基，p22phox的C末端有一富含脯氨酸的尾巴。吞噬細(xì)胞中的NOX通常是靜止的，當(dāng)受到某些胞外因素的刺激時(shí)，胞漿中的p47phox，p67phox，p40phox和Rac通過p22phox上富含脯氨酸的尾巴與之結(jié)合形成酶復(fù)合體，這種結(jié)合能夠使gp91phox活化，從而發(fā)揮生物學(xué)作用[16]。研究已經(jīng)證實(shí)，NOX催化亞單位gp91phox與缺血性腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[17-18]，gp9lphox基因敲除小鼠的缺血性血腦屏障損傷、腦梗死面積均比野生型小鼠顯著地減輕[19-20]，表明NOX2在缺血性血腦屏障損傷中有重要作用，抑制NOX的產(chǎn)生成為I/R后抗氧化治療的主要靶點(diǎn)。

Apocynin 又名加拿大麻素、羅布麻寧，是一種天然存在的甲氧基被取代的鄰苯二酚，分子量為 166.17 道爾頓。被用作中草藥治療炎癥和特定的感染性疾病已經(jīng)有幾百年歷史。近來研究證明 Apocynin 是一種常用的NOX高選擇性抑制劑，它能有效地抑制NOX亞單位的結(jié)合[21]。但是有研究發(fā)現(xiàn)，Apocynin在吞噬細(xì)胞中以二聚體形式抑制NOX的作用，而在非吞噬細(xì)胞(如血管內(nèi)皮或平滑肌細(xì)胞)中則不具有抑制NOX的作用，在體外試驗(yàn)中甚至有刺激活性氧生成的作用[22]。Castor等[23]認(rèn)為，高劑量的羅布麻寧可能具有促氧化作用，較窄的治療劑量范圍會(huì)使其使用受到限制。由于藥物的劑量選擇及特異性，因此臨床應(yīng)用范圍比較局限，有待進(jìn)一步研究。然而電針的安全性及實(shí)用性卻已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于臨床治療腦損傷類疾患[24-25]。

本研究發(fā)現(xiàn)I/R后小鼠腦組織NOX活性增強(qiáng)，干預(yù)各組其活性比模型組均明顯下降，灌注后各時(shí)段，藥物組和電針組NOX活性均比模型組下降，電針組和藥物組比較無明顯差異。I/R后小鼠腦組織NOX2/gp9lphox基因表達(dá)增強(qiáng)，干預(yù)各組的基因表達(dá)均比模型組明顯下降，灌注后各時(shí)段，藥物組和電針組NOX2/gp9lphox基因表達(dá)均比模型組下降，電針組和藥物組比較無明顯差異。表明藥物和電針干預(yù)對(duì)I/R后小鼠腦組織NOX的活性和NOX2/gp9lphox基因表達(dá)有一定的抑制作用，電針可以達(dá)到藥物的相似作用；因此可以推斷電針亦可通過抗氧化應(yīng)激的作用，阻止I/R造成的損傷，并且其保護(hù)作用至少部分是通過對(duì)NOX活性的抑制作用而產(chǎn)生。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠I/R后腦組織NOX活性及NOX2的表達(dá)均迅速增高，電針對(duì)急性I/R后氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響因介入時(shí)間的不同而存在一定差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示越早干預(yù)其下降越明顯，R3 h電針組療效強(qiáng)于R24h、R48 h電針組。提示臨床治療I/R損傷應(yīng)注意針刺時(shí)機(jī)的選擇，I/R后應(yīng)盡早開始電針治療，能夠獲得最大的收益，最大幅度的調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的反應(yīng)。

腦缺血再灌注損傷相當(dāng)于祖國(guó)醫(yī)學(xué)的“中風(fēng)”，歷代醫(yī)家素有“病變?cè)谀X，首取督脈”之說，故本實(shí)驗(yàn)針刺選穴以督脈經(jīng)為主。百會(huì)穴為督脈經(jīng)穴，亦是督脈、足太陽膀胱經(jīng)、手少陽三焦經(jīng)、足少陽膽經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)五條經(jīng)脈的交會(huì)穴，居一身之最高，刺之有通陽啟閉、醒腦利水之功。大椎穴在第七頸椎棘突下，位近于腦部，是手足三陽、督脈的交會(huì)穴?！按搜ㄊ嵌矫}之結(jié)，統(tǒng)乎三陽而助衛(wèi)氣”(《古法新解·會(huì)元針灸學(xué)》)，協(xié)調(diào)陽氣之總綱。因此兩穴相配共奏醒腦開竅、回陽救逆之功。

本研究從新角度深入地探討針刺抗氧化作用的分子學(xué)機(jī)制，解釋針刺治療腦血管疾病的原理，為進(jìn)一步研究非藥物抗氧化療法開辟了新途徑，為臨床上治療腦血管疾病提供新的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)，為防治腦血管疾病展示更廣闊的應(yīng)用前景。