裘博文，郝柳柳，鄧新為，羅娜，趙鶴青，賴寶怡，孫志宏,2*

(1. 延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000；2. 陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西 延安 716000)

巨菌草(Pennisetumgiganteum)是狼尾屬植物，為溫帶和熱帶多年生草本植物。1983年由國家菌草工程技術(shù)研究中心引進，是一種熱利用率高的速生和優(yōu)質(zhì)飼料作物。巨菌草粗蛋白含量高達(dá)54.6%，粗纖維含量高達(dá)33%[1]，其富含多糖和粗蛋白的特征被認(rèn)為可能具有提高動物免疫功能、減少疾病、改善生產(chǎn)性能的多種生理功能[2]，因此將高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的巨菌草納入飼料添加劑研究前景廣闊。

七彩山雞(Phasianuscolchicus)的肉質(zhì)鮮嫩、美味，含人體多種必需氨基酸[3]，是一種高蛋白、低脂肪和低膽固醇的優(yōu)質(zhì)肉類。七彩山雞對飼料營養(yǎng)需求高，通常使用優(yōu)質(zhì)的肉雞飼料來飼養(yǎng)，目前七彩山雞各階段的飼養(yǎng)主要靠生產(chǎn)者自己配制，配制時要特別注意七彩山雞的營養(yǎng)需要量及原料要求。

近幾年，在飼料中添加巨菌草用來降低飼料成本和改善飼養(yǎng)動物的生長健康狀況的研究報道較少且相對單一[4-5]。本試驗通過在基礎(chǔ)飼料中添加不同含量的巨菌草飼喂七彩山雞，根據(jù)血液生理生化指標(biāo)以及脂蛋白脂酶(LPL)基因和鈣激活蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因在肌肉組織中表達(dá)量，探明日糧中添加巨菌草的適宜含量，為后續(xù)指導(dǎo)巨菌草飼料飼養(yǎng)七彩山雞提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 基礎(chǔ)飼料及營養(yǎng)水平

七彩山雞飼料參照雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[6]，并進行適當(dāng)調(diào)整，飼料分別由精料、麩皮和巨菌草搭配而成。選用生長周期為90 d的巨菌草，通過柔絲粉碎晾干后，再與其余飼料加工成顆粒進行飼喂。巨菌草營養(yǎng)成分為：粗灰分19.4%、粗蛋白質(zhì)27.2%、粗脂肪2.2%、粗纖維16%、鈣6.74%、鈣6.74%。各試驗組日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗日糧配方和營養(yǎng)水平(干物質(zhì))

1.2 試驗動物與樣品采集

選用西安市集美生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供的七彩山雞210只(1周齡)，分為1個對照組和4個不同水平巨菌草飼料處理組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)14只。試驗在陜西省延安大學(xué)萃園實訓(xùn)基地進行。試驗開始前對雞舍進行徹底打掃和消毒。每天7:00和16:00投料。飼養(yǎng)周期為16周，飼養(yǎng)管理一致，自由飲水。

飼養(yǎng)試驗結(jié)束時，從每組中各選取12只七彩山雞，共60只，前1 d下午開始禁食，早晨空腹在翅膀處靜脈采集全血，注入血成規(guī)管和生化管中，上下?lián)u動，在延安大學(xué)附屬醫(yī)院進行血液生理生化指標(biāo)的測定。

1.3 七彩山雞LPL基因和CAST基因PCR檢測

運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，根據(jù)七彩山雞LPL基因和CAST基因的序列設(shè)計PCR擴增引物，引物信息見表2，引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。取心、胃、胸和腿肌組織共100 mg，利用試劑盒提取總RNA，用超微量分光光度計檢測總RNA的OD值，OD值在1.8～2.0(實測1.95～2.0)之間，可進行下一步試驗，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche)說明書將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以各七彩山雞最長肌總cDNA為模板，采用表2中引物序列，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為20 μL：RNase-free 水 8 μL，2×T5 Master Mix 10 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，1 260 μg/mL的cDNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)。

表2 引物核苷酸信息

1.4 LPL基因和CAST基因PCR熒光定量檢測

按1.3中的方法提取20種組織的cDNA，心肌、胃、胸肌和腿肌的cDNA各5種。以cDNA為模板進行熒光定量PCR。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：RNase-free 水 7.8 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，通用型SYBR Green 預(yù)混液 10 μL，140 μg/mL 的cDNA模板 2 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)。以β-action基因(GenBank登錄號分別為： NM_205282和NM_001034034.2)作為內(nèi)參基因，對LPL和CAST基因進行標(biāo)準(zhǔn)化，檢測數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt值法計算mRNA相對表達(dá)水平。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件(版本24.0)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用One-way ANOVA方差分析比較不同試驗組的顯著性差異，顯著性水平為P<0.05。基因表達(dá)量采用GraphPad Prism(版本6.0)制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長性能指標(biāo)

由表3可知，4個添加巨菌草組的七彩山雞平均體重都高于對照組，其中以8%添加量最高，差異顯著(P<0.05)；平均日采食量相對于對照組均有所增加，但差異不顯著(P>0.05)；平均日增重顯著大于對照組(P<0.05)，以12%巨菌草組最高；料重比與對照組相比均有所下降，以添加量8%時差異最為明顯(P<0.05)。

表3 七彩山雞生長性能指標(biāo)的測定結(jié)果

2.2 血液生理指標(biāo)

由表4可知，七彩山雞飼糧中加入不同比例的巨菌草對于血液中的紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、胞血紅蛋白濃度(MCHC)和平均紅細(xì)胞體積寬度(RDW-SD)無明顯差異。對照組白細(xì)胞數(shù)(WBC)最低，巨菌草水平為8%的試驗組與其他組相比差異顯著(P<0.05)；8%和12%巨菌草組的紅細(xì)胞比積(HCT)與對照組相比顯著升高(P<0.05)；平均血小板體積(MPV)巨菌草組均高于對照組，其中巨菌草水平為8%和12%的差異顯著(P<0.05)；血小板體積分布寬度(PDW)巨菌草組均低于對照組，8%巨菌草組顯著降低(P<0.05)。

表4 七彩山雞血液生理指標(biāo)的測定結(jié)果

2.3 血液生化指標(biāo)

由表5可知，8%巨菌草組的總蛋白(TP)顯著高于其他組(P<0.05)；白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)和高密度脂蛋白(HDL-C)在添加巨菌草后都有所升高，但差異不顯著(P>0.05)；8%巨菌草組的血清球蛋白(GLO)比對照組明顯升高，且差異顯著(P<0.05)；甘油三酯(TG)含量在添加巨菌草后呈現(xiàn)降低趨勢，以8%添加量的降低幅度最為明顯(P<0.05)；巨菌草組總膽固醇(TC)含量均低于對照組，其中12%添加量差異顯著(P<0.05)；低密度脂蛋白(LDL-C)的含量隨巨菌草添加水平提高表現(xiàn)為下降趨勢，且12%和16%巨菌草組差異顯著(P<0.05)；各組尿素(Urea)含量無明顯差異(P>0.05)。

表5 巨菌草對七彩山雞血液生化指標(biāo)的影響

2.4 LPL基因在不同組織中的表達(dá)

由圖1可知，在胸肌組織中，LPL基因的表達(dá)量隨著日糧中巨菌草含量的增加表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，添加8%和12%巨菌草組與對照組相比差異顯著(P<0.05)；在胃組織中，日糧中添加12%巨菌草時LPL基因的表達(dá)量達(dá)到最高值，且與對照組表達(dá)量相比增高，差異顯著(P<0.05)。 在心肌和腿肌中，添加巨菌草組LPL基因表達(dá)量與對照組無明顯差異(P>0.05)。

注：相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同圖1 LPL基因在胸肌(A)、心肌(B)、腿肌(C)和胃(D)中的表達(dá)量

2.5 CAST基因在不同組織中的表達(dá)

由圖2可知，在胸肌組織中，添加巨菌草組CAST基因表達(dá)量與對照組相比無明顯差異(P>0.05)；而在腿肌組織中，CAST基因在12%巨菌草組的表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)；在胃組織中，CAST基因在8%巨菌草組的表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)；在心肌組織中，CAST基因在12%巨菌草組的表達(dá)量顯著高于其他組(P<0.05)，4%和8%巨菌草組顯著高于對照組(P<0.05)。

圖2 CAST基因在胸肌(A)、腿肌(B)、胃(C)和心肌(D)中的表達(dá)量

3 討論

3.1 巨菌草飼料對七彩山雞生長性能的影響

在畜禽類動物的飼糧中加入巨菌草添加劑，動物的生長和免疫性能都有所改善[7]。禽類對飼料的利用率可以通過增加采食量、進食次數(shù)、多次食糜來改善對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，在羊的飼糧中添加一定量的草粉，可使羊?qū)︼暳现械亩嗵呛痛值鞍椎鹊拇x能力增強，提高羊?qū)︼暭Z的吸收率[9]。在本試驗中，8%巨菌草組七彩山雞的平均體重顯著增加；4組巨菌草組平均日采食量提高但不顯著，日增重均顯著增加，料重比均有所降低，其中8%巨菌草組降低顯著，這些與上述觀點相符合。

3.2 巨菌草飼料對七彩山雞血液生理生化指標(biāo)的影響

白細(xì)胞參與體內(nèi)免疫反應(yīng)，對抵抗體外抗原物質(zhì)有著不可或缺的作用，紅細(xì)胞比積增大可以增加血液的承載能力[10-11]；紅細(xì)胞體積分布寬度、平均紅細(xì)胞體積是反映血液中血小板體積變化的參數(shù)，而平均血小板體積和血小板體積分布寬度一定程度上反映血小板功能和血小板活性，是檢測貧血的重要指標(biāo)[12-13]。血液生化指標(biāo)可以比較準(zhǔn)確地反映動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸之間的平衡狀況，研究表明血清中的總蛋白、白蛋白和球蛋白含量的提高，有助于增強動物體蛋白質(zhì)代謝和營養(yǎng)的吸收[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加8%巨菌草對七彩山雞血液生理指標(biāo)均有所改善，其中白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞比積、平均血小板體積、血小板體積分布寬度差異顯著，表明七彩山雞日糧中添加巨菌草可以促進動物生長發(fā)育，提高動物的免疫力。對生化指標(biāo)來說，添加8%巨菌草可顯著提高七彩山雞血液中的總蛋白、血清球蛋白和甘油三酯含量，因為巨菌草富含粗纖維和粗蛋白，可以改善動物腸絨毛形態(tài)，從而促進對高蛋白和多糖的吸收，進一步改善山雞的血液指標(biāo)，提高山雞的免疫性能。

3.3 巨菌草飼料對脂肪相關(guān)基因表達(dá)的影響

LPL和CAST基因的活躍與否直接影響著動物的生長。LPL基因主要在動物脂肪組織、心肌組織、骨骼肌組織和乳腺組織中表達(dá)，是肉質(zhì)性狀候選基因之一[16-17]；而CAST基因是參與動物體生長、代謝以及機體內(nèi)相應(yīng)的生理生化反應(yīng)過程的調(diào)節(jié)基因之一，它能有效地保護蛋白質(zhì)，以防止被降解，從而加快肌肉的增長[18]。LPL和CAST基因的表達(dá)量可以作為觀察動物生長狀況的重要指標(biāo)。有研究表明，LPL和CAST基因具有促進甘油三酯蛋白降解和調(diào)控肌肉生長過程中蛋白質(zhì)更新的作用，不同的肌組織LPL和CAST基因所需表達(dá)量不同，因此導(dǎo)致各組織之間存在不同的LPL和CAST基因表達(dá)量[19-20]。巨菌草富含多糖，這一特性對于改善動物的腸絨毛形態(tài)具有一定的可能性[21]，同時其富含氨基酸和蛋白質(zhì)的特性為改善動物肉品質(zhì)提供了可能[22]。以上研究均與本研究所得出結(jié)果相吻合。本研究表明，在飼糧中添加不同水平的巨菌草可以使LPL基因出現(xiàn)差異表達(dá)，在飼糧中添加量為8%時，該基因在胸肌和胃的表達(dá)量與其他組織相比差異最為顯著；而對于CAST基因來說，表達(dá)量的多少因添加量的不同而改變，添加8%～12%的巨菌草可以顯著影響CAST基因在心肌、胃、胸肌、腿肌組織中表達(dá)量，但其影響的規(guī)律性有待進一步研究。

4 結(jié)論

通過在七彩山雞日糧中添加不同水平巨菌草飼料發(fā)現(xiàn)，添加8%巨菌草對其生長性能和血液生理生化指標(biāo)均有所改善，可提高免疫力；日糧中添加8%～12%含量的巨菌草，對LPL和CAST兩種重要的脂肪代謝基因的表達(dá)量影響最為顯著，對脂肪的代謝和蛋白質(zhì)的更新有一定的促進作用，但相關(guān)的作用機制還需進一步探索。