韓貴芝 顧宸銘 張丹丹 張正升 張兆強(qiáng) 林 立

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,濟(jì)寧 272013；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院,濟(jì)寧 272011)

心肌缺血性疾病是由于心肌病理性變化引起冠脈供血量和心肌細(xì)胞需求量之間不平衡，導(dǎo)致心肌供血不足引起的損傷，其中最常見為心絞痛和急性心肌梗死[1-2]。大蒜素具有降血脂、擴(kuò)張血管、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、降血壓、防治心腦血管疾病等藥理作用[3-5]。 喬蕾等[6]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用，其機(jī)制主要是增加心肌的抗氧化能力。目前，大蒜素對(duì)心肌缺血保護(hù)作用機(jī)制還不太清楚。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠心肌缺血模型，探討大蒜素對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 成年雄性Wistar大鼠,體重210～225g,由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食、飲水，室溫20℃～25℃，相對(duì)濕度45%～60%，符合動(dòng)物倫理學(xué)原則。

1.1.2材料和試劑 大蒜素純品(上海源葉生物科技有限公司)；CGRP、ET-1 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1大鼠心肌缺血模型的制備 腹腔注射異丙腎上腺素3mg/kg,每天2次，連續(xù)30d，制備大鼠心肌缺血模型[7]。

1.2.2分組及處理 動(dòng)物模型建立后喂養(yǎng)7d，使大鼠適應(yīng)環(huán)境，記錄大鼠的飲水?dāng)z食、精神狀態(tài)、體重等，當(dāng)充分適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為低、中、高劑量組和模型組，正常大鼠作對(duì)照組，每組10只。低、中、高劑量組分別灌胃100mg/kg.bw、200mg/kg.bw、400mg/kg.bw大蒜素，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等容量的生理鹽水。每日灌胃前觀察并記錄各組大鼠的體重、飲水、攝食，精神狀態(tài)等。連續(xù)灌胃30d后，停止灌胃，繼續(xù)喂養(yǎng)7d。用乙醚在麻醉缸中麻醉，摘眼球取血，離心取上層血清。解剖取心臟，稱取1.0g左心室心肌組織，加入1ml PBS,組織勻漿，離心取上清液，冷凍備用。

1.2.3形態(tài)學(xué)觀察 取左心室心尖處心肌組織1～2mm，放在4%多聚甲醛中固定24h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片，HE染色，電光鏡觀察大鼠左心室心肌組織的病理變化。

1.2.4天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)含量的測(cè)定 取血清嚴(yán)格按試劑盒操作說明，采用ELISA方法測(cè)定AST、CK和LDH含量。

1.2.5血清和心肌組織中ET-1、CGRP含量的測(cè)定 取血清和心肌組織勻漿液嚴(yán)格按試劑盒說明操作，采用ELISA方法測(cè)定ET-1和CGRP含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 心肌形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組大鼠心肌組織纖維排列有序紋理清晰，微血管均勻地分布在心肌間質(zhì)中且結(jié)構(gòu)正常；模型組心肌組織纖維排列紊亂模糊，心肌間質(zhì)中充斥著嗜酸性粒細(xì)胞出現(xiàn)嗜酸樣改變，心肌組織紋理出現(xiàn)波浪狀損傷和心肌細(xì)胞和心間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；大蒜素高、中、低劑量組較模型組損傷明顯減輕，心肌纖維組織排列較為規(guī)律整齊，存在少量的點(diǎn)狀嗜酸性染色，未見波浪狀損傷和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。見圖1。

注：a.炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和損傷;b.嗜酸性粒細(xì)胞嗜酸樣改變

2.2 各組大鼠血清AST、LDH和CK含量變化

模型組AST、LDH和CK水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。大蒜素低、中、高劑量組AST、LDH和CK水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清中AST、LDH和CK含量

2.3 各組大鼠血清和心肌組織中ET-1、CGRP含量變化

與模型組相比，大蒜素高、中、低劑量組心肌中ET-1含量顯著降低，CGRP含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠ET-1和CGRP含量

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

3 討論

我國(guó)每年突發(fā)性冠心病心絞痛和急性心肌梗死引起的缺血性心臟病死亡率高達(dá)3.2%，居病因死亡之首。在我國(guó)缺血性心臟病發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，早期預(yù)防和控制是降低缺血性心臟病發(fā)生的重要策略[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對(duì)心肌具有保護(hù)作用，其對(duì)心肌作用的機(jī)制主要包括[9-10]：有效清除超氧陰離子自由基，抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、促進(jìn)擴(kuò)張血管物質(zhì)NO、H2S、NOS的產(chǎn)生、抑制心房心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載鈣拮抗、抑制血小板黏附聚集、降低血漿纖維蛋白原作用、增加纖溶酶活性，促進(jìn)纖溶，阻止血栓形成[11]，延緩心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)受損心肌細(xì)胞的自我修復(fù)等。大蒜素對(duì)心肌缺血性家兔具有明顯的拮抗LVDP升高、+dp/dtmax降低及拮抗心肌缺血期LVSP的作用，通過減輕心臟負(fù)荷，加強(qiáng)左心功能[12-13]。本文結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織受損，肌纖維排列紊亂，出現(xiàn)斷裂、斷層、不清晰，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，大蒜素劑量組心肌組織纖維排列大致規(guī)律，可見部分少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，微血管清晰。說明大蒜素對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用。

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene-relate-d peptide，CGRP)是一種由多個(gè)氨基酸組成的小鏈活性多肽，有舒張血管和收縮心肌的作用，抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡和增殖，參與調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)和神經(jīng)功能等[14]。內(nèi)皮素(endothelin 1，ET-l)由21個(gè)氨基酸組成的活性多肽,具有強(qiáng)烈的促平滑肌增殖和縮血管的作用[15]。有研究表明，通過建立大鼠離體心臟缺血/再灌注模型,避免體液調(diào)節(jié)的影響，通過灌注外源性CGRP和ET-l，檢測(cè)大鼠心臟功能的變化。研究發(fā)現(xiàn)灌注CGRP能明顯的增加心肌組織中CGRP受體的表達(dá)，心功能明顯改善[16]。

大蒜素低、中、高劑量組血清AST、CK和LDH水平較模型組顯著降低，心功能有所改善。大蒜素低、中、高劑量組心肌組織ET含量顯著降低,CGRP含量顯著升高。表明大蒜素可以使血清中具有收縮血管作用的ET含量降低，使心肌組織中具有舒張血管作用的CGRP含量升高，擴(kuò)張心血管，改善心肌供血，改善心肌組織的炎性損傷，達(dá)到保護(hù)心肌的作用。