劉 超 張騰元 朱日明 高鑫芯 高慧婕

(濟寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826)

槐耳，中藥全名為槐栓菌，學(xué)名TrametesrobiniophilaMurr，屬于木耳科真菌，是一種生長在老齡中國槐樹上的高等真菌子實體[1]?；倍俏覈鴤鹘y(tǒng)醫(yī)學(xué)重要的藥用真菌[2]，具有“治風(fēng)，破血，益力”功效[3]，民間常用于治療癌癥和炎癥[4]?；倍甯?Huaieraqueousextract)是槐耳的提取產(chǎn)物，其最主要的活性成分為多糖蛋白[5]。多項研究證實，槐耳清膏可明顯增強機體細胞免疫應(yīng)答，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及抗病毒等功能[6]。目前，有關(guān)槐耳的研究主要集中于抗腫瘤及其免疫調(diào)節(jié)活性的研究[7-9]，而對其抗炎活性研究較少。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞膜外膜的主要組成成分，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)。LPS可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生炎癥及炎癥性細胞因子的釋放，常用于制備膿毒癥模型[10]。本實驗使用LPS構(gòu)建小鼠膿毒癥模型[11]，探討槐耳清膏對機體的抗炎活性及作用機制，為槐耳及其復(fù)方制劑槐杞黃的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 實驗采用ICR健康小鼠，體質(zhì)量243g，雌雄各半，由青島市實驗動物和動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK(魯)2003001001。

1.1.2試劑與儀器 槐耳清膏(啟東蓋天力藥業(yè)有限公司贈送)，LPS(索萊寶科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific Fermentas公司)，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(武漢基因美生物科技公司)。熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)、酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)、DYY-7C電泳儀(北京六一公司)、凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及LPS致炎模型制備 50只ICR小鼠飼養(yǎng)一周后，隨機分為5組：正常對照組、LPS組、槐耳清膏低劑量組(4mg/kg)、中劑量組(6mg/kg)和高劑量組(8mg/kg)，每組10只。采用腹腔注射LPS制備小鼠致炎模型。采用灌胃給藥，槐耳低、中、高組分別灌服不同濃度的槐耳清膏0.2ml/只/d，正常對照組和LPS組灌服給予等體積的生理鹽水，共計7d。第7天灌胃后0.5h，每組腹腔注射等體積的LPS 0.2ml(10mg/kg)，正常對照組注射等體積的生理鹽水。

1.2.2脾臟指數(shù)測定 注射LPS 6h后，稱重后處死小鼠，分離脾臟，用濾紙拭去表面殘留血液，立即稱重。脾臟指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)[12]。

1.2.3HE染色觀察LPS致炎癥模型小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響 取小鼠肺組織于4%的多聚甲醛中固定，常規(guī)HE染色，切片機連續(xù)切片，厚度4～6μm。鏡下觀察，全景掃描。

1.2.4外周血IL-6、TNF-α表達水平測定 注射LPS 6h后，取小鼠外周血于室溫靜置10min，2500rpm離心20min，分離血清，參照ELISA試劑盒說明書進行操作，加入終止液后，使用多功能酶標(biāo)儀，分別測量各個樣本內(nèi)IL-6、TNF-α表達水平。

1.2.5RT-q PCR測定小鼠脾臟組織IL-6、TNF-α mRNA的含量 取小鼠脾臟組織0.1g，Trizol法提取小鼠總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后行RT-qPCR檢測IL-6、TNF-α mRNA表達水平。引物序列參照表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 槐耳清膏對LPS致小鼠炎癥模型脾臟指數(shù)的影響

LPS組脾臟指數(shù)較正常對照組均明顯升高，說明LPS致炎癥模型制備成功?；倍?、高劑量組的脾臟指數(shù)較LPS組顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組小鼠脾臟指數(shù)比較

2.2 槐耳清膏對LPS致小鼠炎癥模型肺臟組織形態(tài)學(xué)的影響

LPS組小鼠肺泡內(nèi)有炎癥性細胞的大量浸潤，肺泡壁增厚，肺泡上皮細胞增生明顯(圖1A)。與LPS組相比，槐耳高劑量組肺組織內(nèi)有少量的炎癥性細胞浸潤，肺泡組織及肺泡支氣管均無明顯變化(圖1B)。

圖1 LPS組(A)和槐耳高劑量組(B)小鼠肺組織HE染色(×100)

2.3 槐耳清膏對LPS致小鼠炎癥模型血清IL-6、TNF-α表達的影響

LPS組小鼠血清IL-6、TNF-α的表達與正常對照組相比顯著上升，炎癥性細胞因子的表達升高，說明LPS致炎小鼠造模成功?；倍小⒏邉┝拷MIL-6、TNF-α表達較LPS組明顯降低，而槐耳低劑量組無顯著變化。見表3。

表3 5組小鼠IL-6、TNF-α比較

2.4 槐耳清膏對LPS致小鼠炎癥模型脾臟組織IL-6、TNF-α mRNA表達的影響

LPS組小鼠IL-6、TNF-α mRNA表達較正常對照組均顯著上升，提示LPS致小鼠脾臟炎癥。與LPS組相比，槐耳高劑量組IL-6、TNF-α mRNA表達均有所下降，而中、低劑量組無明顯變化，(P<0.05)。見表4。

表4 5組小鼠脾臟IL-6、TNF-α mRNA表達的比較

3討 論

炎癥是機體對刺激的一種防御反應(yīng)，但過度炎癥反應(yīng)與許多疾病密切相關(guān)，比如心血管系統(tǒng)疾病[13]、癌癥[14]等，因此對炎癥的監(jiān)測和控制對多種疾病意義重大[15]。其中，由細菌等生物病原體引起的炎癥又稱感染性炎癥；LPS為是革蘭氏陰性細菌細胞壁的一種成分，可以激活機體產(chǎn)生IL-6、TNF-α 等大量炎性因子，從而導(dǎo)致機體出現(xiàn)發(fā)熱、毛細血管通透性增加和中性粒細胞浸潤等多種炎性反應(yīng)。本實驗采用腹腔注射LPS法制備小鼠炎癥模型，結(jié)果顯示LPS模型組小鼠出現(xiàn)了行動遲緩、精神不振等現(xiàn)象，同時檢測發(fā)現(xiàn)血清及脾臟組織中炎癥性細胞因子IL-6、TNF-α的表達顯著增加，LPS模型組小鼠肺臟出現(xiàn)大量中性粒細胞浸潤，炎癥反應(yīng)明顯，這也與既往文獻報道一致[16-17]，說明LPS致膿毒癥模型小鼠制備成功。

槐耳是我國古代醫(yī)學(xué)重要的藥用真菌，具有“治風(fēng)，破血，益力”的功效[3,18]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點，“治風(fēng)，破血”即為消炎，“益力”可以理解為增強免疫力?；倍且晃恫豢啥嗟玫目寡字兴帲淇寡谆钚院拖嚓P(guān)抗炎機制，值得深入研究。目前對槐耳及其復(fù)方制劑的研究主要集中于其抗腫瘤活性及調(diào)節(jié)免疫作用，而對其最傳統(tǒng)的抗炎活性研究尚少。因此，本實驗重點研究槐耳的抗炎活性。

TNF-α是一類由活化的巨噬細胞和NK細胞釋放的促炎性細胞因子，參與局部炎癥和內(nèi)皮細胞的活化。急性炎癥時，炎癥局部產(chǎn)生的TNF-α可提高中性粒細胞的吞噬活性，促進白細胞分化[19-21]。IL-6 也是多效性的炎癥性細胞因子，是形成炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。IL-6 不僅參與炎癥反應(yīng)，而且直接導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，同時也通過促進其他炎癥因子的釋放間接導(dǎo)致炎癥，激活中性粒細胞，因此，IL-6 既是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)， 也是促進炎癥的始動因素[22]。本文結(jié)果顯示，槐耳中、高劑量組小鼠外周血血清及脾臟組織中IL-6、TNF-α 水平均顯著降低，提示較高濃度的槐耳清膏可以下調(diào)體內(nèi)TNF-α和IL-6的表達，其機制可能是槐耳清膏可以有效地減少由LPS所致炎癥引發(fā)的TNF-α 和IL-6的過度釋放，清除體內(nèi)的炎癥介質(zhì)，減少炎癥的滲出，促進炎癥吸收，抑制LPS所致炎癥。

綜上所述，槐耳清膏對LPS致小鼠炎癥模型有很好的抗炎活性，可能通過抑制炎癥性細胞因子的過度釋放，減輕機體炎癥性細胞浸潤來降低機體炎癥反應(yīng)，為治療與炎癥密切相關(guān)的腫瘤、心血管疾病等提供了新的治療思路。