肖 棟 元雪芳 段月嵐 李 進(jìn) Mohamed Keita，2Martial Le Prince Essengue Samboukel，2 何 環(huán)

(1. 中國(guó)礦業(yè)大學(xué)煤炭資源與安全開(kāi)采國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省徐州市，221116；2. 中國(guó)礦業(yè)大學(xué)礦業(yè)工程學(xué)院，江蘇省徐州市，221116；3. 煤與煤層氣共采國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西省晉城市，048000；4.徐州市第一人民醫(yī)院，江蘇省徐州市，221116；5.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇省徐州市，221116)

微生物法煤炭氣化開(kāi)采是煤炭流態(tài)化開(kāi)采技術(shù)方法之一[1]。伴隨采礦深度的增加，地溫升高、地壓增大，以及煤層水文地質(zhì)條件復(fù)雜[2]、煤炭運(yùn)輸成本增加等難題成為限制超深煤層開(kāi)采的關(guān)鍵影響因素[3]。

煤層微生物的活動(dòng)需要溫度較高、物質(zhì)豐富的水資源，且微生物的耐壓能力較強(qiáng)[4]，這使得煤炭生物氣化技術(shù)能夠極好地適應(yīng)超深煤層地質(zhì)條件[5]；所以利用微生物對(duì)煤中有機(jī)質(zhì)進(jìn)行降解，在地下煤層中可將固態(tài)資源轉(zhuǎn)化為氣態(tài)資源[6]。而且，煤炭氣化開(kāi)采能夠解決固態(tài)煤炭運(yùn)輸成本高的難題。因此，煤炭生物氣化的技術(shù)發(fā)展可以為超深煤層常規(guī)開(kāi)采難的問(wèn)題提供一種有效的技術(shù)解決方法。

產(chǎn)甲烷微生物菌群是實(shí)現(xiàn)煤炭微生物氣化的關(guān)鍵菌群[7]，當(dāng)前產(chǎn)甲烷菌群對(duì)煤的降解關(guān)鍵特征、生物群落結(jié)構(gòu)[8]、菌群的培育與誘導(dǎo)方法等研究相繼展開(kāi)[9]。研究結(jié)果表明，多數(shù)煤地質(zhì)產(chǎn)甲烷菌以乙酸發(fā)酵型產(chǎn)甲烷菌為主，部分煤層伴有二氧化碳還原性菌種[10]。關(guān)于對(duì)乙酸代謝途徑的煤的生物降解特征研究證實(shí)，煤炭發(fā)酵過(guò)程是由水解菌群、發(fā)酵菌群、產(chǎn)乙酸菌群和產(chǎn)甲烷菌群等功能性微生物類(lèi)群共同作用完成[11]。

產(chǎn)乙酸菌是自然界普遍存在的一類(lèi)微生物，主要以水溶性糖類(lèi)物質(zhì)、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、小分子酸、醇類(lèi)等碳水化合物為碳源[12]，通過(guò)生物代謝產(chǎn)生乙酸的微生物。乙酸菌的代謝特點(diǎn)是以質(zhì)子作為唯一的電子受體，所以進(jìn)行的大多數(shù)氧化反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)熱力學(xué)狀態(tài)下是吸能的[13]，該菌種的生長(zhǎng)需要較高的環(huán)境溫度，其代謝產(chǎn)物的集聚對(duì)菌群的生長(zhǎng)和代謝具有抑制作用[14]。在產(chǎn)甲烷菌群系統(tǒng)中，產(chǎn)甲烷菌和硫酸鹽還原菌與產(chǎn)乙酸菌形成共生關(guān)系[15]，并且在營(yíng)養(yǎng)傳遞鏈中產(chǎn)甲烷菌和硫酸鹽還原菌位于產(chǎn)乙酸菌之后，它們對(duì)乙酸的消耗降低了乙酸聚集對(duì)乙酸菌的抑制作用[16]。共生關(guān)系對(duì)保持煤層地質(zhì)產(chǎn)甲烷菌群中乙酸菌的活性能夠起到至關(guān)重要的作用，由此，煤層地質(zhì)微生物群中產(chǎn)乙酸特征菌屬的多樣性研究為進(jìn)一步開(kāi)展煤層地質(zhì)產(chǎn)甲烷微生物群落代謝途徑與代謝組學(xué)研究具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌群和煤樣

本項(xiàng)研究所采用的產(chǎn)甲烷菌群取自山西晉城無(wú)煙煤礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司寺河礦。礦區(qū)位于沁水煤田東南邊緣，礦井面積約為230 km2，南北走向長(zhǎng)約為12 km，東西傾斜寬約為23 km，地質(zhì)儲(chǔ)量為15億t。井田主采煤層分為3號(hào)、9號(hào)和15號(hào)煤層，總厚度為10.32 m。煤種為低硫、低-中灰、高發(fā)熱量、高機(jī)械強(qiáng)度的無(wú)煙煤[17]。其中，15號(hào)煤層已證實(shí)存有休眠狀態(tài)的產(chǎn)甲烷微生物群，并成功利用該煤層菌群實(shí)現(xiàn)煤的生物氣化試驗(yàn)[18]。本次實(shí)驗(yàn)用菌群來(lái)自15號(hào)煤層，取掘進(jìn)頭新揭露塊狀煤樣為本次實(shí)驗(yàn)富集菌群所需樣品，煤樣采集一是取塊體短邊不小于150 mm，二是取樣位置未受注水等作業(yè)影響，三是煤樣需從新揭露煤壁采用掏槽法取樣，四是取樣過(guò)程避免供風(fēng)直吹、水淋、肢體直接接觸等環(huán)境污染。新取煤樣快速置入無(wú)菌自封袋，并采用氮?dú)獯祾?，減少煤樣與空氣接觸、保持煤樣處于厭氧狀態(tài)。煤塊在實(shí)驗(yàn)室氮?dú)獗Ｗo(hù)下破碎，塊體粒度為5～10 mm，破碎后的塊體采用氮?dú)獗Ｗo(hù)并置于4 ℃的冷藏箱中待用。

1.2 培養(yǎng)基配置與實(shí)驗(yàn)裝配

實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了3種培養(yǎng)基，分別是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(BP：牛肉膏為3 g/L、蛋白胨為10 g/L、NaCl為10 g/L)[15]、馬鈴薯淀粉葡萄糖培養(yǎng)基(PSG：馬鈴薯淀粉為200 g/L、葡萄糖為20 g/L、酵母抽提物為0.5 g/L)[19]、葡萄糖小分子酸培養(yǎng)基(GSMA：葡萄糖為20 g/L、酵母抽提物為0.5 g/L、甲酸鈉為6.8 g/L、乙酸鈉為8.2 g/L)。3種培養(yǎng)基各配置1200 mL，配置好的培養(yǎng)基用0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。

BP培養(yǎng)基是一種應(yīng)用十分廣泛的天然培養(yǎng)基，在前期試驗(yàn)中該培養(yǎng)基能夠成功對(duì)煤層產(chǎn)甲烷菌群實(shí)現(xiàn)活化[18]。BP培養(yǎng)基中的牛肉膏能夠?yàn)槲⑸锾峁┨荚础⒘姿猁}和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，NaCl提供無(wú)機(jī)鹽；PSG培養(yǎng)基以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)去除瓊脂組分后完成配置，其中馬鈴薯淀粉為微生物提供碳源和多種營(yíng)養(yǎng)，葡萄糖提供碳源、酵母提取物提供微量元素與生長(zhǎng)因子[19]；GSMA培養(yǎng)基由葡萄糖提供主要碳源，酵母提取物提供微量元素與生長(zhǎng)因子，乙酸鹽和甲酸鹽模擬乙酸菌代謝產(chǎn)物，提高溶液中代謝產(chǎn)物濃度，增加干擾設(shè)置，培養(yǎng)基配置中，甲酸鈉與乙酸鈉采用相同的摩爾濃度配置(0.1 mol/L)。每升培養(yǎng)基中加入W/V 為0.1%的刃天青1 mL作為厭氧指示劑，該指示劑在氧化還原電位為100 mV以上時(shí)顯示藍(lán)色，隨著氧化還原電位的降低，逐漸轉(zhuǎn)為淡粉色，當(dāng)氧化還原電位達(dá)到-40 mV以下時(shí)顯示無(wú)色[20]。配置好的培養(yǎng)基采用上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的型號(hào)為L(zhǎng)DZF-75KB立式壓力蒸汽滅菌器進(jìn)行滅菌，BP培養(yǎng)基采用1.05 kg/cm2的壓力，在121℃和20 min內(nèi)滅菌2次，PSG培養(yǎng)基和GSMA培養(yǎng)基采用1.05 kg/cm2的壓力，在111℃和20 min內(nèi)滅菌2次(溫度設(shè)置為111℃是為了防止葡萄糖高溫分解)。滅菌后培養(yǎng)基采用氮?dú)獗Ｗo(hù)冷卻至室溫，移至英國(guó)DWS公司生產(chǎn)的型號(hào)為DG500的厭氧培養(yǎng)箱中備用。

實(shí)驗(yàn)采用500 mL的血清瓶為培育器皿。將21個(gè)滅菌后的血清瓶進(jìn)行標(biāo)記，然后根據(jù)標(biāo)記分別在厭氧培養(yǎng)箱中分裝3種培養(yǎng)基，每瓶200 mL。每種培養(yǎng)基設(shè)置5個(gè)平行樣、2個(gè)無(wú)菌樣。3種培養(yǎng)基的5個(gè)平行樣中添加煤塊5.0±0.1 g，厭氧培養(yǎng)箱中用基丁膠塞密封，并用鋁蓋封口。裝配完成的試樣放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)40℃避光培養(yǎng)，震蕩速度設(shè)置為80 rpm。

1.3 產(chǎn)乙酸菌群產(chǎn)氣和產(chǎn)酸特征分析

實(shí)驗(yàn)中采用注射器對(duì)各實(shí)驗(yàn)樣品的產(chǎn)氣量進(jìn)行周期測(cè)定，容積產(chǎn)氣率見(jiàn)式(1)：

(1)

式中：VLRin——第i個(gè)培養(yǎng)單元第n次容積產(chǎn)氣率，L/(L·d)；

Vin——1 atm條件下第i個(gè)培養(yǎng)單元第n次測(cè)試產(chǎn)氣總體積，mL；

Vvi——第i個(gè)培養(yǎng)單元培養(yǎng)基總量，mL；

Tin——第i個(gè)培養(yǎng)單元第n次測(cè)試時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，h；

Ti(n-1)——第i個(gè)培養(yǎng)單元第n-1次測(cè)試時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，h。

排出混合氣樣中的H2、CO2和CH4含量測(cè)定采用安捷倫7890A氣相色譜儀進(jìn)行，色譜柱為Agilent Carbonplot(60 m×320 μm)，載氣為高純氮?dú)?99.999%)，填充柱進(jìn)樣口溫度為150℃，隔墊吹掃流量為3 mL/min，進(jìn)樣量為500 μL，柱箱溫度為25℃，保持7.5 min，采用TCD檢測(cè)器檢測(cè)溫度為200℃，參比流量為400 mL/min，尾流量為8 mL/min。H2的出峰時(shí)間為3.2 min，CH4的出峰時(shí)間為3.7～4 min，CO2的出峰時(shí)間為4.4 min。

甲酸、乙酸、丙酸等揮發(fā)性小分子酸采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定，該設(shè)備由安捷倫7890A氣相色譜儀與5975C質(zhì)譜儀組成。色譜柱采用VF-WAXms色譜柱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。程序升溫設(shè)置如下：初始溫度為80℃，以10℃/min的速率升溫至100℃后保持3 min，以15℃/min升溫至150℃后保持5 min，再以運(yùn)行溫度為250℃保持5 min。進(jìn)樣口為無(wú)分流模式，溫度為280℃，吹掃速率為15 mL/min，吹掃時(shí)間為0.2 min。載氣為99.999%的高純度氦氣，柱流速為1.0 mL/min。

BP、PSG培養(yǎng)基中小分子酸測(cè)試時(shí)，混合標(biāo)樣中3種酸的質(zhì)量比如下：甲酸∶乙酸∶丙酸=1∶1∶1。測(cè)試中首先對(duì)標(biāo)樣進(jìn)行測(cè)試，得到不同酸的出峰時(shí)間和峰高，獲得3種小分子酸的線性關(guān)系，然后測(cè)試樣品。

GSMA培養(yǎng)基中小分子酸測(cè)定時(shí)，混合標(biāo)樣設(shè)計(jì)為“3種酸+2種鹽”，質(zhì)量比∶甲酸∶乙酸∶丙酸∶甲酸鈉∶乙酸鈉=1∶1∶1∶1∶1。測(cè)試中首先對(duì)標(biāo)樣進(jìn)行測(cè)試，得到不同酸以及鹽的出峰時(shí)間和峰高，獲得不同酸與鹽的線性關(guān)系，然后測(cè)試樣品，以排除培養(yǎng)基中甲酸鈉和乙酸鈉對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響。

1.4 淀粉與還原糖檢出測(cè)定

采用碘-碘化鉀溶液檢測(cè)培養(yǎng)基中是否含有淀粉。稀釋后的碘-碘化鉀溶液與淀粉作用時(shí)，會(huì)形成碘化淀粉，并呈藍(lán)色的特殊反應(yīng)，淀粉的水解物糊精遇碘變紅。測(cè)試時(shí)，用移液器于各平行樣取培養(yǎng)液1 mL加入小試管，滴入標(biāo)準(zhǔn)碘-碘化鉀溶液，根據(jù)變色反應(yīng)，測(cè)定培養(yǎng)基中是否含有淀粉。

采用本尼迪特試劑測(cè)定培養(yǎng)基中是否含有還原糖。還原糖環(huán)境中，本尼迪特試劑中的CuSO4中的Cu2+被還原成Cu+，并以Cu2O的形式沉淀出來(lái)。如果溶液中還原糖含量較低，產(chǎn)生的Cu2O相應(yīng)減少，試驗(yàn)后會(huì)出現(xiàn)綠色、混濁的黃色或橙色沉淀物。測(cè)試時(shí)，用移液器于各平行樣取培養(yǎng)液2 mL加入小試管，加入1 mL標(biāo)準(zhǔn)本尼迪特試劑，搖勻后將此混合物在沸水中加熱，反應(yīng)時(shí)間3 min。根據(jù)變色反應(yīng)，測(cè)定培養(yǎng)基中是否含有還原糖(葡萄糖等)。

1.5 產(chǎn)乙酸菌群的群落結(jié)構(gòu)分析

產(chǎn)氣產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)中，每種培養(yǎng)基平行樣各抽取10 mL混合后至于100 mL無(wú)菌離心管中，以此每種培養(yǎng)基共獲取50 mL菌液作為菌樣。利用冷凍離心機(jī)12000×g離心10 min，倒掉上清液，收集離心管內(nèi)的菌沉淀在溫度為-20℃的條件下凍存用于提取DNA。DNA提取方法采用寶生物工程(大連)有限公司水樣DNA提取試劑盒提取方法進(jìn)行，檢測(cè)委托上海美吉生物科技有限公司完成。收集的菌樣用小型珠磨式研磨器破碎，經(jīng)SDS與Proteinase K消化、酚-氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌沉淀后，加入滅菌雙蒸水溶解沉淀得到微生物總基因組DNA。0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取基因組DNA 的長(zhǎng)度及完整性。

提取的基因組DNA作為模板進(jìn)行細(xì)菌16SrRNA 基因V1-V3 區(qū)片段的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物采用21F、1492R(21F:5′-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3′、1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，隨后以94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min；72℃保溫10 min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物凍存，委托廣州賽哲生物科技有限公司完成高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析。

1.6 產(chǎn)甲烷菌的鑒定

試驗(yàn)中采用熒光顯微鏡觀察法對(duì)培育系統(tǒng)中是否含有產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行鑒定。產(chǎn)甲烷菌在420 nm紫外光激發(fā)下產(chǎn)生藍(lán)-綠色熒光[18]。該檢測(cè)方法利用了產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞中含有輔酶F420和甲基喋呤類(lèi)化合物具備420 nm紫外照射下具備熒光激發(fā)這2個(gè)特征[21]。目前除了甲烷菌外還未發(fā)現(xiàn)其他厭氧菌具備這一特征，因此420 nm熒光檢測(cè)是作為產(chǎn)甲烷菌鑒定的重要方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)乙酸菌富集培育過(guò)程中產(chǎn)乙酸量和pH變化

試驗(yàn)中采用BP培養(yǎng)基、PSG培養(yǎng)基、GSMA培養(yǎng)基這3種培養(yǎng)基對(duì)煤樣中的產(chǎn)乙酸菌進(jìn)行培育。培育溫度為40℃、振蕩頻率為80 rpm。每種培養(yǎng)基設(shè)置空白樣2個(gè)。試驗(yàn)中任何一個(gè)空白樣出現(xiàn)產(chǎn)氣或刃天青變色均判定為實(shí)驗(yàn)污染，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中分別在第5天和第10天對(duì)培養(yǎng)基中的淀粉、還原糖、3種小分子酸(甲酸、乙酸、丙酸)濃度和培養(yǎng)液酸堿度進(jìn)行測(cè)定。測(cè)試完成每種培養(yǎng)基5個(gè)平行數(shù)據(jù)中取結(jié)果最接近的3組數(shù)據(jù)取平均值計(jì)為本次測(cè)試結(jié)果。

首先從培養(yǎng)基的利用情況分析，采用碘-碘化鉀溶液和本尼迪特試劑對(duì)培育5 d后3組培育組是否含有淀粉與還原糖進(jìn)行了測(cè)定，產(chǎn)乙酸菌富集培育過(guò)程中3種培養(yǎng)基中淀粉與還原糖含量測(cè)定見(jiàn)表1。

由表1可以看出，淀粉檢測(cè)中BP、GSAM呈陰性，PSG呈陽(yáng)性。即培育后第5天，PSG中的淀粉未被完全水解。還原糖檢測(cè)中，BP、PSG 、GSAM這3種培養(yǎng)基均呈陽(yáng)性。該結(jié)果證明，BP培養(yǎng)基中的部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被水解為還原糖，PSG、GSMA中仍存在一定量的還原糖未被完全降解。

表1 產(chǎn)乙酸菌富集培育過(guò)程中3種培養(yǎng)基中淀粉與還原糖含量測(cè)定

小分子酸與pH測(cè)試結(jié)果表明，3種培養(yǎng)基自第5天，均測(cè)到一定濃度的乙酸，伴隨培育時(shí)間的增長(zhǎng)，乙酸濃度總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，各組均未檢測(cè)到甲酸與丙酸。培育后第5天，PSG培養(yǎng)基中乙酸濃度最高，達(dá)到120.10 mmol/L；其次為GSM培養(yǎng)基，乙酸濃度為87.53 mmol/L；BP培養(yǎng)基的乙酸濃度變化最小，乙酸濃度僅為19.61%。3種培養(yǎng)基中酸堿度變化與乙酸濃度成正比，3種培養(yǎng)基pH酸性特征順序?yàn)镻SG(pH=5.1)、GSM(pH=6.2)、BP(pH=6.9)。

培育第10天，對(duì)培養(yǎng)基中淀粉、還原糖、小分子酸、pH值進(jìn)行了第2次測(cè)定。首先淀粉與還原糖分析結(jié)果如下：淀粉檢測(cè)結(jié)果表明，BP、PSG、GSAM均呈陰性，即培育后第10天，PSG中的淀粉完全水解。還原糖檢測(cè)結(jié)果表明，BP呈陽(yáng)性(顏色呈綠色)，PSG 、GSAM培養(yǎng)基均程陰性。該結(jié)果證明，BP培養(yǎng)基中含有少量還原糖，PSG、GSMA中的還原糖已被完全降解。

乙酸測(cè)試結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)10 d的培育，乙酸濃度最高的培育組依然是PSG培養(yǎng)組，乙酸濃度達(dá)到231.26 mmol/L，乙酸增長(zhǎng)率為92.56%；其次為GSM培育組，乙酸濃度上升至152.49 mmol/L，乙酸增長(zhǎng)率為74.21%；BP培養(yǎng)基乙酸濃度則為25.47 mmol/L，該培養(yǎng)基中乙酸增長(zhǎng)率為29.88%。 此時(shí)，3種培養(yǎng)基的酸堿度分別為BP(pH=6.5)、PSG(pH=3.8)、GSMA(pH=4.3)。3種培養(yǎng)基培育實(shí)驗(yàn)第5天和第10天各組乙酸含量和pH變化如圖1所示。

3組培養(yǎng)基2次測(cè)試結(jié)果表明，馬鈴薯淀粉葡萄糖培養(yǎng)基(PSG培養(yǎng)基)獲得最佳的乙酸富集，葡萄糖小分子酸培養(yǎng)基(GSMA培養(yǎng)基)的最終乙酸濃度為PSG最終濃度的65.93%，相對(duì)而言，BP培養(yǎng)基未成功獲得顯著的乙酸富集。

圖1 3種培養(yǎng)基培育實(shí)驗(yàn)第5天和第10天各組乙酸含量和pH變化

培養(yǎng)基中乙酸濃度的變化能夠間接反應(yīng)產(chǎn)乙酸菌是否被富集。由于乙酸是有機(jī)質(zhì)代謝產(chǎn)甲烷的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，當(dāng)乙酸菌與具有乙酸降解特征的產(chǎn)甲烷菌等共同生長(zhǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中乙酸濃度變化將不顯著。試驗(yàn)中的BP培養(yǎng)基對(duì)煤中微生物群進(jìn)行培育時(shí)即出現(xiàn)該類(lèi)情況，3種培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌富集培育第5天和第10天培養(yǎng)基菌群鏡檢如圖2所示。

由圖2(a)和圖2(f)可以看出， BP培育組第5天和第10天培養(yǎng)基試樣在420 nm紫外線照射下能夠觀測(cè)到藍(lán)綠色光斑，圖中每個(gè)藍(lán)綠光斑為單個(gè)或多個(gè)產(chǎn)甲烷菌，證明BP培養(yǎng)基培育被同步培育。利用圖像提取反相處理后，圖2(a)和圖2(f)中的藍(lán)綠光斑以黑色斑點(diǎn)展現(xiàn)在白色背景中，對(duì)比圖2(b)和圖2(g)，結(jié)合圖2(c)和圖2(h)首先能清晰觀測(cè)到代表產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的斑點(diǎn)/斑塊數(shù)量變化與總菌群群落數(shù)量變化的趨勢(shì)關(guān)系，由此證實(shí)BP培育系統(tǒng)中的產(chǎn)甲烷菌從培育第5天到培育第10天與其他菌種共同增長(zhǎng)，并被顯著富集。

由圖2(d)、圖2(e)、圖2(i)和圖2(j)可以看出，PSG和GSMA培育組中菌種數(shù)量伴隨培育時(shí)間增加，并同樣呈現(xiàn)顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)，但是熒光觀測(cè)未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌。

這一結(jié)果證明，BP培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)對(duì)乙酸菌等菌種培育的同時(shí)，也實(shí)現(xiàn)了對(duì)產(chǎn)甲烷菌的培育。

2.2 產(chǎn)乙酸菌富集過(guò)程中的產(chǎn)氫規(guī)律

產(chǎn)乙酸菌發(fā)酵過(guò)程中有2種類(lèi)型菌種，一種是產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌，另一種是不產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌，2種菌種具備相同的產(chǎn)乙酸特性，但是產(chǎn)氣特征不同。為深入觀測(cè)寺河礦15號(hào)煤層產(chǎn)乙酸菌種是否具備產(chǎn)氣特征，試驗(yàn)中每天對(duì)各培育組的容積產(chǎn)氣率進(jìn)行了測(cè)定與統(tǒng)計(jì)，各培育組實(shí)驗(yàn)期間H2、CO2、總?cè)莘e產(chǎn)氣率與累積容積產(chǎn)氣率變化曲線如圖3所示。

圖2 3種培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌富集培育第5天和第10天天培養(yǎng)基菌群鏡檢

圖3 3組培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)期間H2、CO2、總?cè)莘e產(chǎn)氣率與累積容積產(chǎn)氣率變化曲線

容積產(chǎn)氣率測(cè)定表明，PSG與GSMA培養(yǎng)基均在第2天產(chǎn)氣， BP培養(yǎng)基在培育后第4天開(kāi)始產(chǎn)氣，產(chǎn)H2過(guò)程中均伴生CO2氣體。生物成氣組分中，PSG培養(yǎng)組產(chǎn)氣中的H2平均體積濃度為56.63%，GSMA培育組產(chǎn)氣中H2濃度略低，其體積濃度為53.25%。培育期間， BP組總產(chǎn)氣率最低。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，該實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氣正處于緩慢升高階段。

對(duì)該實(shí)驗(yàn)組分析中發(fā)現(xiàn)，生物成氣組分中H2體積濃度保持在8%以下，CO2平均體積濃度為55.29%，除此之外該培養(yǎng)組產(chǎn)氣中測(cè)得CH4濃度平均為36.71%。試驗(yàn)中PSG和GSMA分別在第9天和第8天停止產(chǎn)氣。生物產(chǎn)氣過(guò)程停止原因如下所述。

(1)各培養(yǎng)基中的碳源是乙酸菌代謝基礎(chǔ)，培育終點(diǎn)通過(guò)淀粉與還原糖檢出實(shí)驗(yàn)證明，PSG培養(yǎng)基中的淀粉已被完全水解，并且PSG與GSMA中的還原糖被充分利用，因此培養(yǎng)基底物的匱乏是導(dǎo)致生物成氣停止的原因之一。

(2)常規(guī)培育實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，培育系統(tǒng)的pH值低于4.5時(shí)，會(huì)出現(xiàn)酸抑制，并且隨著酸性的增加，抑制效果更加明顯。至培育終點(diǎn)，PSG培養(yǎng)基的pH為3.8，GSMA培養(yǎng)基的pH為4.3，培養(yǎng)系統(tǒng)偏酸，抑制了產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌活性。

試驗(yàn)中，PSG培育組最大容積產(chǎn)氣率出現(xiàn)在第6天和第7天，容積產(chǎn)氣率達(dá)到1.11 L/(L·d)，在第2天到第6天內(nèi)，容積產(chǎn)氣率一直處于上升階段，此階段也是產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的快速生長(zhǎng)階段，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，該培育組最大累積容積產(chǎn)氣量為4.83 L/L；GSMA最大容積產(chǎn)氣率出現(xiàn)在第4天到第6天，容積產(chǎn)氣率為0.72 L/(L·d)，第2天到第4天是該培養(yǎng)基產(chǎn)氣上升期，該組培育中最大累積容積產(chǎn)氣量為2.95 L/L。

2.3 各培育組菌群結(jié)構(gòu)分析

實(shí)驗(yàn)中分別在第5天和第10天對(duì)3種培育條件下培育系統(tǒng)中的生物多樣性進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)豐度在0.1%以上的菌種進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。高通測(cè)序結(jié)果表明，伴隨培育時(shí)間的增長(zhǎng)，各培育系統(tǒng)中的菌種多樣性呈遞減的趨勢(shì)發(fā)展，并且不同培養(yǎng)基的不同菌種的富集效果不同。其中富集效果最好的是PSG培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能夠很好的實(shí)現(xiàn)對(duì)TerrisporobacterSP.的富集。培育5 d時(shí)，培育系統(tǒng)豐度大于0.1%的菌屬為CitrobacterSP.、TerrisporobacterSP.和EnterococcusSP.等。經(jīng)過(guò)10 d培育后，該培養(yǎng)組富集出TerrisporobacterSP.菌屬，相對(duì)豐度大于98%。3種培育方式對(duì)寺河煤層產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌富集中生物多樣性的變化如圖4所示。

圖4 3種培育方式對(duì)寺河煤層產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌富集中生物多樣性的變化

BP培育組在培育后第5天，豐度大于0.1%的菌屬有9種，培育終點(diǎn)，該組培養(yǎng)基主要完成富集的菌屬包括BacteroidesSP.、CitrobacterSP.、CupriavidusSP.、TerrisporobacterSP.和DysgonomonasSP.，共計(jì)5種；GSMA培育組第5天的菌屬測(cè)序中，豐度大于0.1%的菌屬為Citrobacter SP.、ClostridiumSP.、EnterococcusSP.、LachnoclostridiumSP.、ParaclostridiumSP.、TerrisporobacterSP.共計(jì)6種，經(jīng)過(guò)10 d培育后，ClostridiumSP.、EnterococcusSP.、LachnoclostridiumSP.和TerrisporobacterSP.等4種菌屬被富集。

通過(guò)菌種多樣性伴隨培育時(shí)間的變化分析，首先BP、PSG、GSMA這3個(gè)培育組中均培育了TerrisporobacterSP.菌屬。據(jù)文獻(xiàn)記載，TerrisporobacterSP.為嚴(yán)格厭氧發(fā)酵菌，可以利用各種糖、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸作為底物[22]，乙酸是該菌屬的標(biāo)志性產(chǎn)物，并且代謝中伴隨H2和CO2生成[23]，純化培育中，該細(xì)胞呈桿狀。本實(shí)驗(yàn)所富集的菌株具有顯著的產(chǎn)氣能力，氣體產(chǎn)物以H2和CO2為主，H2濃度大于50%。根據(jù)培養(yǎng)基組分，該菌株具備將還原糖轉(zhuǎn)化為乙酸的特性。由于在培育前5天，培養(yǎng)基中處于淀粉、葡萄糖和淀粉水解產(chǎn)物復(fù)合狀態(tài)，并且菌群中除了TerrisporobacterSP.菌屬外，還包含CitrobacterSP.、EnterococcusSP.等，因此本次試驗(yàn)中無(wú)法確定該菌種是否會(huì)釋放胞外淀粉酶淀粉水解酶。但根據(jù)后5天菌種的富集結(jié)果，該菌種在PSG營(yíng)養(yǎng)條件下具有利用還原糖為營(yíng)養(yǎng)的快速生長(zhǎng)能力，并且對(duì)其他周?chē)木N具有較強(qiáng)的抑制性，從而使該菌種能在培育期間快速形成優(yōu)勢(shì)菌種。

其次，GSMA培育中，除TerrisporobacterSP.之外，還富集了ClostridiumSP.、EnterococcusSP.、LachnoclostridiumSP.等3種。其中EnterococcusSP.是一種革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧發(fā)酵菌，外形呈球狀，又名腸球菌。該菌種多以雙球或短鏈形式存在，代謝中產(chǎn)酸、產(chǎn)氫特征不顯著[23]；ClostridiumSP.為梭狀芽胞桿菌屬桿狀細(xì)菌(見(jiàn)圖4)、多數(shù)菌種為革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，該菌種廣泛分布于土壤、淡水、海洋沉積物以及動(dòng)物的腸道中。菌種大小根據(jù)種類(lèi)不同差異較大，從0.6～3 μm，最長(zhǎng)7 μm。ClostridiumSP.菌屬中的某些菌株的能夠利用H2和CO2產(chǎn)生乙酸[24]。LachnoclostridiumSP.嚴(yán)格厭氧發(fā)酵桿菌，具備發(fā)酵糖類(lèi)物質(zhì)并轉(zhuǎn)化為乙酸的代謝特征，代謝中產(chǎn)氣特征不顯著[25]。

綜合各組培育方法、乙酸富集、產(chǎn)氣特征分析，PSG培養(yǎng)基富集了TerrisporobacterSP.菌屬，GSMA富集了TerrisporobacterSP.、EnterococcusSP.、LachnoclostridiumSP.這3種菌屬，由此證明了寺河礦煤層地質(zhì)微生物群中產(chǎn)乙酸特征菌是由多種產(chǎn)乙酸菌構(gòu)成的菌群，該菌群具備利用還原糖等碳水化合物產(chǎn)生乙酸的代謝。除此，菌群中還存在有類(lèi)似ClostridiumSP.菌屬，可以利用產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的代謝產(chǎn)物H2和CO2生成乙酸，以生物合成的方式提高系統(tǒng)乙酸濃度。結(jié)合GSMA培養(yǎng)基與PSG培養(yǎng)基，在培育系統(tǒng)中存在乙酸鹽和甲酸鹽情況下，對(duì)TerrisporobacterSP.菌屬的競(jìng)爭(zhēng)具有一定抑制作用，該條件下能夠獲得除TerrisporobacterSP.菌屬之外的多種具有產(chǎn)乙酸特征菌種的富集。BP培養(yǎng)基提供了更為均衡的營(yíng)養(yǎng)，該條件下產(chǎn)甲烷菌群能夠獲得一定程度的生長(zhǎng)(PSG和GSMA中均為通過(guò)熒光顯微鏡觀察到產(chǎn)甲烷菌)，但是該培育條件下不利于產(chǎn)乙酸菌的富集。

3 結(jié)論

研究中首選利用3種不同碳結(jié)構(gòu)培養(yǎng)基對(duì)寺河礦15號(hào)煤層中的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌進(jìn)行了為期10 d的培育。培育中選取第5天和第10天分別對(duì)培養(yǎng)基中乙酸含量、酸堿度水平、淀粉與還原糖存在狀態(tài)以及生物多樣性進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)培育中對(duì)每個(gè)平行樣每天容積產(chǎn)氣率進(jìn)行了跟蹤測(cè)定。綜合以上因素，本試驗(yàn)研究結(jié)果如下所述。

(1)不同培養(yǎng)基對(duì)寺河礦15號(hào)煤層產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌產(chǎn)生不同的培育結(jié)果。其中BP培養(yǎng)基基本保持了原煤地質(zhì)微生物菌群所具備的產(chǎn)甲烷特征，未能富集產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌。PSG與GSMA培養(yǎng)基各自實(shí)現(xiàn)具備菌種結(jié)構(gòu)特征的產(chǎn)乙酸特征菌的富集。

(2)PSG培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)了對(duì)TerrisporobacterSP.菌屬的富集，該菌屬具備利用還原糖產(chǎn)乙酸的特征，H2和CO2是該菌株的代謝伴生產(chǎn)物。經(jīng)10 d培育，培養(yǎng)基中的淀粉與葡萄糖均被降解。

(3)GSMA培育結(jié)果證實(shí)，甲酸鈉和乙酸鈉對(duì)TerrisporobacterSP.菌屬形成優(yōu)勢(shì)菌屬具有抑制性，該培養(yǎng)基培育條件下完成對(duì)ClostridiumSP.、EnterococcusSP.、LachnoclostridiumSP.和TerrisporobacterSP.等4種菌屬的富集。其中TerrisporobacterSP.菌屬具備典型的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸特征；LachnoclostridiumSP.菌屬不具有產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸特征；而ClostridiumSP.菌屬則具有利用其它菌種代謝生成H2和CO2的特征，以及通過(guò)代謝合成生成乙酸的能力。3種菌屬在具備產(chǎn)乙酸特征的同時(shí)，又各自具有獨(dú)特的代謝方式。

(4)產(chǎn)乙酸菌的富集證明，寺河礦15號(hào)煤層中存有不止一種屬種的產(chǎn)乙酸菌，并且部分菌種代謝中具備顯著的產(chǎn)H2和CO2特征，還存有菌屬可以利用H2和CO2產(chǎn)生乙酸。而B(niǎo)P實(shí)驗(yàn)組的生物多樣性與產(chǎn)氣特征有待進(jìn)一步證實(shí)，寺河礦煤層中的產(chǎn)甲烷菌群具備乙酸降解型發(fā)酵特征，從PSD與GSMA富集菌種的代謝產(chǎn)氣特征表明，煤層中除乙酸發(fā)酵性產(chǎn)甲烷菌外，還存有二氧化碳還原性產(chǎn)甲烷菌的可能性。