曲 穎，高 原，鄒奇緣，高星宇，王亞旭

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱 150076）

精油是通過蒸餾、萃取、吸附或壓榨等方式從芳香植物的花、葉、皮、種子、果實(shí)等提取出來的具備芳香氣味和揮發(fā)性的油狀類物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品以及醫(yī)藥領(lǐng)域[1]。植物精油具有廣譜抑菌、殺菌功能，有望成為天然抗菌劑，得到眾多科研人員的青睞[2]。本文通過水蒸氣蒸餾法提取丁香、降香、連翹3 種精油，并對(duì)3 種精油的體外抑菌活性進(jìn)行了測(cè)定，為藥用植物精油的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 8739）、金色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus ATCC 6538）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ATCC 6633）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis ATCC13076）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosaATCC14442）、變異鏈球菌（Streptococcus mutans ATCC 35668）哈爾濱商業(yè)大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所保存；

連翹、丁香、降香由哈爾濱三棵樹藥材市場(chǎng)購入。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其它試劑均為分析純。

SX-700 型高壓滅菌（TOMY）；ELx800 酶標(biāo)儀（BioTek）；FE38 電導(dǎo)率儀（METTLER TOLEDO）；HALO DB-20 紫外分光光度計(jì)（Dynamica）；潔凈工作臺(tái)HD L（北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司）；BP-9082精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.2.1 植物精油的提取 本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法對(duì)植物精油進(jìn)行提取。將中藥飲片粉碎，過80 目，浸泡2h 后，按料液比1∶20 加入加熱蒸餾4h，獲得溜出液后加入適量NaCl，使水層與油層分離。將油層分離，并加入少量無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，過濾，得到植物精油[3]。

1.2.2 植物精油的抑菌活性測(cè)定

1.2.2.1 植物精油抑菌圈的測(cè)定 采用濾紙片法對(duì)植物精油進(jìn)行抑菌活性研究。無菌條件下在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上涂布100μL 濃度107CFU·mL-1致病菌菌懸液，將浸泡30min 五種植物精油的滅菌濾紙片（直徑6mm）擺放于培養(yǎng)基上，陽性對(duì)照為氨芐青霉素（0.4mg·mL-1），37℃培養(yǎng) 24h 后，觀察記錄結(jié)果，測(cè)量每一個(gè)抑菌圈的直徑[4]。

1.2.2.2 丁香精油的MIC 及MBC 實(shí)驗(yàn) 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定，通過二倍肉湯稀釋法，采用96孔板，對(duì)丁香精油進(jìn)行抑菌活性研究，將丁香精油用少量DMSO 溶解后作為母液，營養(yǎng)肉湯進(jìn)行倍比稀釋，得到系列梯度濃度樣品，分別加入105CFU·mL-1的致病菌，37℃過夜培養(yǎng)12h，觀察菌液生長情況，菌液透明澄清時(shí)所對(duì)應(yīng)的藥液濃度即為MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

最小殺菌濃度（MBC）是根據(jù)MIC 的測(cè)定結(jié)果，選取MIC、2MIC 和4MIC 對(duì)應(yīng)樣品的菌液，并點(diǎn)植于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)12h，觀察病原菌生長狀況，不生長菌落對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度即為MBC[5]。

1.2.3 丁香精油的膜滲透性實(shí)驗(yàn) 將金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基于37℃120r·min-1過夜培養(yǎng)至 107CFU·mL-1，培養(yǎng)液經(jīng)12000r·min-1，離心 2min，棄上清，沉淀用 PBS 溶液洗滌、重懸。分別加入不同濃度的丁香精油（0.5MIC、MIC、2MIC），空白對(duì)照加入等體積的 PBS，37℃培養(yǎng)24h，選取 1、2、4、8、12h，進(jìn)行 12000r·min-1, 離心2min，取上清。在260nm 下測(cè)量紫外分光光度值[6]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物精油抑菌圈的測(cè)定

通過水蒸氣蒸餾裝置提取并獲得植物精油。3種植物精油對(duì)選取的幾種細(xì)菌均產(chǎn)生明顯的抑菌圈。根據(jù)抑菌圈大小推測(cè)抑菌能力為丁香精油抑菌能力強(qiáng)于其他精油，不同種類精油的抑菌圈直徑見表1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取丁香精油完成。

表1 不同種類精油的抑菌圈直徑（cm）Tab.1 Diameter of antibacterial circle of different essential oils（cm）

2.2 丁香精油的MIC 及MBC 實(shí)驗(yàn)

進(jìn)一步選取丁香精油對(duì)5 種常見致病菌進(jìn)行MIC 和MBC 值的測(cè)定，其中丁香精油對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的MIC 值分別為7 和14μL·mL-1，見表2。綜合抑菌圈直徑、MIC 值、MBC 值發(fā)現(xiàn)丁香精油對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌具有較好的抑菌效果。

表 2 丁香精油對(duì) 5 種細(xì)菌的 MIC、MBC 值（μL·mL-1）Tab.2 MIC and MBC values of clove essential oil against five bacteria（μL·mL-1）

2.3 丁香精油對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假擔(dān)孢菌的膜滲透性影響

通過丁香精油作用金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌培養(yǎng)物后，檢測(cè)12h 內(nèi)260nm 處菌體上清OD值，如圖 1a、b 所示。在 0.5MIC、MIC、2MIC 濃度丁香精油作用下，菌體內(nèi)的DNA 隨著時(shí)間的推移，向細(xì)胞外出現(xiàn)一定的泄露。其中金黃色葡萄球菌在0～8h內(nèi)，上清DNA 濃度增加較為明顯，且高濃度丁香精油在12h 內(nèi)有明顯作用優(yōu)勢(shì)。銅綠假單孢菌在0～4h內(nèi)上清DNA 濃度變化緩慢，4～8h 出現(xiàn)明顯上升。推測(cè)植物精油可破壞微生物的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，引起細(xì)胞膜通透性改變[7]。

圖1 丁香精油對(duì)菌株膜滲透性的影響Fig.1 Effect of clove essential oil on membrane permeability of bacterial strain

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過水蒸氣蒸餾法從藥用植物連翹、丁香、降香中提取了連翹精油，丁香精油以及降香精油，并比較了3 種植物精油對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、變異鏈球菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 種藥用植物精油均有一定抗菌效果，且抑菌活性為：丁香精油>連翹精油>降香精油。進(jìn)一步對(duì)丁香精油進(jìn)行膜滲透性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，丁香精油能夠改變細(xì)胞膜滲透性，并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)菌死亡。本文為藥用植物精油的開發(fā)及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。