孟繁欽 李彥偉 孟令鍇 趙玉佳

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

0 引言

杭白菊(chrysanthemum morifolium)為菊科植物菊的干燥頭狀花絮，性微寒，味苦、甘，具有重要的藥用價(jià)值[1]。作為杭白菊主要藥理活性成分的揮發(fā)油，其組成包括單萜、三萜、倍半萜及其簡單含氧衍生物，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痙、解熱和抗腫瘤等作用[2-4]。超臨界CO2萃取技術(shù)是通過控制壓力和溫度使CO2處于超臨界狀態(tài)，使其與欲分離的物質(zhì)接觸進(jìn)行萃取，之后使超臨界流體恢復(fù)為普通氣體狀態(tài)，目標(biāo)物則完全或基本析出，從而達(dá)到分離提純的目的。文章采用Box-Behnken響應(yīng)面法，以杭白菊揮發(fā)油萃取率為響應(yīng)指標(biāo)，研究萃取壓力、萃取溫度及萃取時(shí)間三個(gè)影響因素的交互作用，優(yōu)選超臨界CO2萃取杭白菊揮發(fā)油的最佳工藝。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

杭白菊，安國市祁澳中藥飲片有限公司；CO2氣體(純度≥99.0%)，牡丹江市金瑞氣體有限公司。HA220-50-06型超臨界萃取裝置；AF-20S型中藥粉碎機(jī)，溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司。

1.2 方法

(1)超臨界CO2萃取杭白菊揮發(fā)油。稱量50g過100目篩的杭白菊粉末裝入料筒后，將其置于1L萃取釜中密封。待CO2液化并且萃取溫度和萃取壓力至設(shè)定值后，開始循環(huán)萃取，達(dá)到萃取時(shí)間，收集分離釜內(nèi)的杭白菊揮發(fā)油，精確稱量其質(zhì)量并計(jì)算萃取率。杭白菊揮發(fā)油萃取率計(jì)算公式(1)：

(2)杭白菊揮發(fā)油萃取工藝單因素實(shí)驗(yàn)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)，在固定分離壓力5MPa，分離溫度40℃的條件下，分別考察不同萃取壓力(10、20、30、40MPa)、萃取溫度(30、40、50、60℃)及萃取時(shí)間(30、60、120、180min)對萃取率的變化影響。

(3)杭白菊揮發(fā)油萃取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以杭白菊揮發(fā)油萃取率(Y)為響應(yīng)值，采用 Design-Expert 11軟件的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)定萃取壓力(A)、萃取溫度(B)及萃取時(shí)間(C)三個(gè)自變量的因素水平，見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表

(4)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)合超臨界萃取設(shè)備操作實(shí)際情況的，對最佳工藝條件進(jìn)行整定。在整定的最優(yōu)工藝條件下，進(jìn)行萃取杭白菊揮發(fā)油，平行實(shí)驗(yàn)3次，得出萃取率平均值。通過比較預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值驗(yàn)證模型的可靠性，確定最終優(yōu)化工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)不同萃取壓力對萃取率的影響。在固定萃取溫度為40℃、萃取時(shí)間60min的操作條件下，考察了杭白菊揮發(fā)油萃取率受不同萃取壓力的影響。在萃取壓力升高的過程中，杭白菊揮發(fā)油萃取率呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢，當(dāng)萃取壓力上升到20MPa時(shí)萃取率達(dá)最大值。

(2)不同萃取溫度對萃取率的影響。在固定萃取壓力為20MPa、萃取時(shí)間60min的操作條件下，考察了不同萃取溫度對杭白菊揮發(fā)油萃取率的影響。在萃取溫度升高的過程中，杭白菊揮發(fā)油萃取率呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢，當(dāng)萃取溫度增大為50℃時(shí)萃取率達(dá)最大值。

(3)不同萃取時(shí)間對萃取率的影響。在固定萃取壓力為20MPa、萃取溫度為40℃的操作條件下，考察了杭白菊揮發(fā)油萃取率受不同萃取時(shí)間的影響。在萃取時(shí)間不斷延長的過程中，杭白菊揮發(fā)油萃取率在萃取時(shí)間達(dá)到120min前呈現(xiàn)不斷增大的趨勢，時(shí)間繼續(xù)延長后萃取率基本不變。

2.2 杭白菊揮發(fā)油萃取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken模型實(shí)驗(yàn)法設(shè)計(jì)的17組實(shí)驗(yàn)，各組實(shí)驗(yàn)情況見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)借助Design-Expert 11軟件進(jìn)行多元回歸分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，得到以杭白菊揮發(fā)油萃取率(Y)為因變量，萃取壓力(A)、萃取溫度(B)和萃取時(shí)間(C)為自變量的回歸方程，對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=4.24+0.2694A+0.1071B-0.1473C+0.0649A B+0.1272AC+0.2305BC-0.4606A2-0.1402B2-0.3434C2。

由響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)回歸方差分析結(jié)果可知，本研究回歸模型F=82.63，P＜0.0001，表明模型高度顯著。實(shí)驗(yàn)所選模型的相關(guān)系數(shù)R2=09907，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男Ｕ嚓P(guān)系數(shù)，說明實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有97.87%受實(shí)驗(yàn)因素的影響。杭白菊揮發(fā)油得率回歸模型能夠代表杭白菊揮發(fā)油實(shí)際萃取得率。對模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2對杭白菊揮發(fā)油萃取率影響顯著(P＜0.05)。杭白菊揮發(fā)油萃取率受各個(gè)因素的影響不是單純的線性關(guān)系，從表3可知，A＞C＞B，對其萃取工藝影響因素從大到小排序?yàn)檩腿毫Γ据腿r(shí)間＞萃取溫度。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)回歸方差分析表

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

采用Design-Expert 11軟件對萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間3因素間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面法分析，依據(jù)回歸模型繪制出以杭白菊揮發(fā)油萃取率為響應(yīng)值的三維曲面圖，結(jié)果見圖1～3。依據(jù)圖中三維響應(yīng)曲面的形狀，對影響杭白菊揮發(fā)油萃取率的任意兩種影響因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析與評價(jià)。影響因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可根據(jù)等高線的形狀進(jìn)行判斷，形狀若呈橢圓形表示因素交互作用顯著，若呈圓形則與之相反[5]。從圖1～3中可以看出各因素間的交互作用顯著，圖1顯示，當(dāng)固定萃取時(shí)間為120min時(shí)，萃取壓力從15MPa增大到25MPa，萃取溫度從45℃增大到55℃的過程中，杭白菊揮發(fā)油萃取率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢；圖2顯示，當(dāng)固定萃取溫度為50℃時(shí)，隨著萃取壓力(15MPa＜P＜25MPa)與萃取時(shí)間(90min＜T＜150min)的增大，杭白菊揮發(fā)油萃取率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢；圖3顯示，當(dāng)固定萃取壓力為20MPa時(shí)，隨著萃取溫度(45℃＜t＜55℃)與萃取時(shí)間(90min＜T＜150min)的增大，杭白菊揮發(fā)油萃取率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。由各三維響應(yīng)曲面圖可知，響應(yīng)值存在最大值，即萃取率最大值點(diǎn)。通過響應(yīng)面優(yōu)化，杭白菊揮發(fā)油超臨界CO2萃取最佳工藝條件為：萃取壓力21.77MPa、萃取溫度52.41℃、萃取時(shí)間120.18min，該條件下杭白菊揮發(fā)油萃取率為4.308%。

圖1 萃取壓力-萃取溫度的響應(yīng)值三維曲面圖

圖2 萃取壓力-萃取時(shí)間的的響應(yīng)值三維曲面圖

圖3 萃取溫度-萃取時(shí)間的的響應(yīng)值三維曲面圖

2.4 最優(yōu)萃取工藝確定與驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果結(jié)合設(shè)備操作實(shí)際情況的可行性，將杭白菊揮發(fā)油超臨界CO2萃取最佳工藝條件選定為：萃取壓力22MPa、萃取溫度52℃、萃取時(shí)間120min。按此條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，杭白菊揮發(fā)油平均萃取率為4.293%，理論值與實(shí)際值之間的相對誤差為3.41%，差異不顯著，說明該方法與實(shí)際情況擬合良好。

3 結(jié)語

本研究以杭白菊揮發(fā)油萃取率為響應(yīng)指標(biāo)，運(yùn)用響應(yīng)面法中Box-Behnken模式設(shè)計(jì)，對超臨界CO2萃取杭白菊揮發(fā)油工藝中的萃取壓力、萃取溫度及萃取時(shí)間三個(gè)影響因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，優(yōu)選出最佳萃取工藝，為杭白菊資源充分利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有一定實(shí)用和推廣價(jià)值。